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Analyse eines Protein-Mikroschalters durch FTIR-Differenzspektroskopie

Gegenstand der Untersuchung: der Ionic-lock-Mikroschalter in Rhodopsin

Abb.1
Struktur von Opsin1)

Anhand einer Röntgenstrukturanalyse von aktivem Opsin (Abb. 1) , dem Liganden-freien Apoprotein (vgl. Apoenzym) des Rhodopsins, identifizierte man am Institut für Medizinische Physik und Biophysik der Berliner Charité (IMPB) den aktiven Zustand eines Mikroschalters (Abb. 3) innerhalb der Klasse A von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren.2, Er besteht aus den Aminosäuren Glu134, Arg135 und Tyr223, die alle hochkonserviert3) sind.

Glu134 und Arg135 sind in der inaktiven Rhodopsin-Konformation (Abb. 2) über eine sogenannte Salzbrücke (Ionenpaar-Bindung) gebunden. Der Begriff beschreibt die enge Nachbarschaft eines positiv (hier Arginin) und eines negativ geladenen Aminosäure-Rests (hier Glutamat) unter Ausbildung einer ionischen Bindung. Wie im beschriebenen Fall tragen Salzbrücken oft wesentlich zur Stabilisierung der Konformation von Proteinen bei. Diese stabile ionische Bindung bescherte dem Mikroschalter seinen Namen: ionic lock.

Die Bedeutung der inaktiven Konformation des Ionic-lock-Mikroschalters wurde in der Literatur vielfach beschrieben.4),5, Seine aktive Konformation war allerdings bis zur Veröffentlichung der Opsin-Struktur unbekannt. Auch das Tyr223 war noch nicht als Schlüssel-Aminosäure erkannt. Weil es hochkonserviert ist, lag es nahe, dass es eine wichtige Rolle im Protein spielt. Da die Seitenkette dieser Aminosäure im inaktiven Zustand aber nach außen in die Membran zeigt (Abb. 2) , vermutete niemand, dass es eine Bindung mit dem Arg135 eingehen würde, von dem bereits bekannt war, dass es eine Schlüsselrolle spielen muss.

In der aktiven Rhodopsin-Konformation6) erkennt man im Gegensatz zur inaktiven einerseits Änderungen der Sekundärstruktur: Helix 6 (gelb-orange, unten) bewegt sich nach außen und Helix 5 (gelb, rechts) nach innen. Andererseits sieht man eine neue Wasserstoff-Brückenbindung zwischen Arg135 und Tyr223.

Abb.2
inaktive Rhodopsin-Konformation
Abb.3
aktive Rhodopsin-Konformation

Der Ionic-lock-Mikroschalter ist rot umrandet. Die Pfeile deuten an, wohin sich Helix 6 und 5 bewegen, wenn das Rhodopsin aus dem Dunkelzustand heraus aktiviert wird.E134 ist der Ein-Buchstaben-Code für Glutaminsäure an Position 134. R steht für Arginin, T für Threonin und Y für Tyrosin.

Chemische 2D-Strukturformel zur Veranschaulichung der Salzbrücke im ionic lock

Erst durch diese Strukturaufklärung hat sich gezeigt, dass das Tyrosin an das Arginin bindet und tatsächlich eine wichtige Rolle im ionic lock spielt. Diese Erkenntnis war der Auslöser für die Untersuchungen des IMPB7), die im Folgenden beschrieben werden. Es galt zu klären, welche Rolle der Mikroschalter spielt und wie er funktioniert. Die Arbeitsgruppe um Priv.-Doz. Franz Bartl hatte eine Reihe von Fragen:

  • Wie genau funktioniert der Übergang zwischen inaktivem und aktivem Mikroschalter?
  • Wann wird der Ionic-lock-Mikroschalter betätigt?
  • Initiert das Tyrosin den Übergang zwischen inaktiver und aktiver Form oder reagiert es nur?
  • Welche Rolle spielt das Tyrosin für die Signalweiterleitung an das G-Protein?
2)Elgeti, M.; Kazim, R.; Heck, M.; Morizumi, T.; Ritter, E.; Scheerer, P.; Ernst, O.; Siebert, F.; Hofmann, K.; Bartl, F. (2011): Conserved Tyr223(5.58) Plays Different Roles in the Activation and G-Protein Interaction of Rhodopsin. In: J. Am. Chem. Soc.. 133 , 7159-7165
3)Von hochkonservierten Aminosäuren spricht man im Allgemeinen dann, wenn sich in mehr als 90% aller untersuchten Proteine die genannte Aminosäure an der gleichen Stelle befindet.
4)Ballesteros, J.; Jensen, A.; Liapakis, G.; Rasmussen, S.; Shi, L.; Gether, U.; Javitch, J. (2001): . In: J. Biol. Chem.. 276 , 29171-29177
5)Vogel, R.; Mahalingam, M.; Lüdeke, S.; Huber, T.; Siebert, F.; Sakmar, T. (2008): . In: J. Mol. Biol.. 380 , 648-655
6)Streng genommen handelt es sich bei der beschriebenen aktiven Rhodopsin-Konformation um die Opsin-Struktur. Von aktivem Rhodopsin konnte bislang keine Röntgenstrukturanalyse gemacht werden, weil es zu schnell in Opsin und Retinal zerfällt. Man geht davon aus, dass das Opsin der aktiven Rhodopsin-Konformation strukturell gleicht und analysierte deshalb dessen Struktur. Diese wird heute von den meisten Wissenschaftlern als aktive Rhodopsin-Konformation akzeptiert.
7)IMPB: Institut für Medizinische Physik und Biophysik der Berliner Charité
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