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Analyse eines Protein-Mikroschalters durch FTIR-Differenzspektroskopie

Die Metazustände von Rhodopsin

Die Röntgenstrukturanalyse arbeitet unter sehr künstlichen Bedingungen: Die Zellmembran wird durch Detergenzien entfernt, was zu unnatürlichen Konformationsänderungen führen kann. Die Kristallisation und die energiereiche Röntgenstrahlung können zudem die Struktur der Proteine verändern. Ein weiterer entscheidender Nachteil der Röntgenstrukturanalyse ist, dass sie nur "Schnappschüsse" einzelner (bei diesen Bedingungen stabilisierter) Protein-Konformationen liefert. Da das inaktive Rhodopsin (Dunkelzustand) nicht in einem Schritt aktiviert wird, sondern diverse Zwischenzustände durchläuft (Abb. 1) , wäre es von Vorteil, jeden einzelnen Zustand stabilisieren zu können, um eine detaillierte Aussage über die Aktivierungsreaktion treffen zu können.

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Abb.1
Schematische Darstellung der Gleichgewichtszustände von Rhodopsin

Nachdem das inaktive Rhodopsin (Dunkelzustand) Licht absorbiert hat, relaxiert der Rezeptor erst über einige Zwischenzustände (Intermediate) in die Meta-Gleichgewichtszustände, ein System von gekoppelten chemischen Gleichgewichten

Die einzelnen Zustände sind charakterisiert durch inaktive bzw. aktive Zustände von Mikroschaltern und damit verbundenen Konformationsänderungen. So sind im Meta-I-Zustand die meisten Schalter inaktiv und in Meta IIbH+ alle Schalter aktiv und beim Übergang von Meta I nach Meta IIa wird der Mikroschalter "Schiff'sche Base" aktiviert. Der Übergang von einem zum anderen Zustand ist nicht zwangsläufig auf das Umlegen von einem Mikroschalter beschränkt. Etwa die Meta-IIb-Bildung beinhaltet große strukturelle Änderungen und ist mit Sicherheit mit der Aktivierung mehrerer Mikroschalter verbunden.

Es ist sehr wahrscheinlich, dass unter den speziellen Bedingungen der Kristallisation (zur 3D-Strukturbestimmung) diese Gleichgewichte verschoben sind und ggf. sogar Zustände bevölkert werden, die unter physiologischen Bedingungen sehr unwahrscheinlich sind. Die Fourier-Transform-Infrarot-Spekroskopie, kurz FTIR(-Spektroskopie), hingegen bietet die Möglichkeit, das Protein in einer Membran und unter verschiedenen äußeren Bedingungen (pH-Wert, Temperatur u.a.) zu untersuchen. Die energiearme Infrarotstrahlung ist im Gegensatz zur Röntgenstrahlung nicht-invasiv und induziert keine Konformationsänderungen oder Strahlenschädigungen im Protein. So können die Meta-Gleichgewichte fast beliebig verschoben werden und Aussagen über die einzelnen Zustände getroffen werden.

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