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Analyse eines Protein-Mikroschalters durch FTIR-Differenzspektroskopie

Untersuchungen am Meta-IIc-Zustand

Abb.1
Rhodopsin in Anwesenheit eines Fragments des Transducins "CTα-K341L" (lila)

Ein weiteres Experiment mit Rhodopsin in Anwesenheit eines Fragments des Transducins (das G-Protein des Rhodopsins), sollte klären, ob und inwiefern die Tyr223-Seitenkette an der Bindung und Signalübertragung zum G-Protein beteiligt ist. Es ist bekannt, dass diese C-terminale Sequenz von elf Aminosäuren das Rhodopsin stabil bindet - insbesondere die hier verwendete modifizierte Variante des Peptids (CTα-K341L), für dessen Komplex mit Rhodopsin eine Kristallstruktur erstellt wurde. (Abb. 1) zeigt diese Struktur von der cytoplasmatischen Seite. Man erkennt deutlich, wie das Peptid genau in der Tasche bindet, die durch die Auswärtsbewegung der Helix 6 (beim Übergang zu Meta IIb) gebildet wird und an deren Unterseite sich das Arg135 befindet, das an das Tyr223 gebunden ist.

Differenzspektroskopie an Meta IIc

Das FTIR-Differenzspektrum (Abb. 2) des Komplexzustandes Meta IIc (entspricht dem Meta-IIb-Zustand des Rhodopsins, der an ein G-Protein-Fragment gekoppelt ist) zeigt im Großen und Ganzen zwei zusätzliche scharfe, positive Differenzbanden bei 1.658cm-1 und 1.550cm-1. Betrachtet man die Spektren der am Tyr223 mutierten Proteine, erkennt man, dass die Komplex-spezifischen Banden stark vermindert auftreten. Dies zeigt, dass Tyr223 nicht nur notwendig ist, um den Meta-IIbH+-Zustand zu erreichen, sondern auch, um den Komplex zu bilden.

Abb.2
FTIR-Differenz- und Doppeldifferenzspektren vom Meta-IIc-Zustand

Oben ist das Differenzspektrum "Meta-IIc-Zustand minus Dunkelzustand" des Wildtyps in schwarz dargestellt, die Differenzspektren der Mutanten in grau darunter. Farblich hervorgehoben sind die Doppeldifferenzspektren.

Fluoreszenzmessung an Meta IIc

Diese Resultate der Doppeldifferenzspektroskopie an Meta IIc wurden durch Fluoreszenzmessungen überprüft, welche die katalytische Aktivität des Rezeptors gegenüber dem G-Protein messen. Dazu wurden die Proben mit Licht der Wellenlänge 280nm angeregt und die Emission bei 330nm aufgezeichnet. Aktivierte G-Proteine besitzen eine geringfügig höhere intrinsische Fluoreszenz als inaktive.

Abb.3
Fluoreszenzmessungsspektren vom Meta-IIc-Zustand

(Abb. 3) zeigt, dass deutlich weniger Transducin-Moleküle pro Sekunde aktiviert werden, wenn eine mutierte Tyr223-Seitenkette eingesetzt wird. Die Signalübertragung von Rezeptor zu G-Protein wird also stark beeinflusst. Am schlechtesten funktioniert sie mit Tyr223Ala (Y223A), das nur 6% der Aktivität des Wildtyps zeigt. Tyr223Phe (Y223F, 46%) und Tyr223Glu (Y223E, 41%) zeigen immerhin fast die Hälfte der Ausgangsaktivität, was folgende Schlüsse zulässt:

  1. Tyr223Glu kann mit Arg135 interagieren, also als Teil des Mikroschalters fungieren. Es aktiviert besser als Tyr223Ala. Dies zeigt, dass die Stabilisierung des Arg135 durch Tyr223 (Abb. 1) eine Rolle bei der effizienten Signalübertragung spielt.
  2. Noch wichtiger als die Stabilisierung des Arg135 scheinen die hydrophoben Kontakte des G-Proteins mit dem Phenol-Ring von Tyr223 zu sein. Dies zeigt, dass der unpolare Ring des Tyr223 Teil der hydrophoben G-Protein-Bindungsstelle ist, denn Tyr223Phe, das ebenfalls einen unpolaren Ring besitzt, aktiviert das G-Protein von allen untersuchten Mutationen am besten.
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