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Analyse eines Protein-Mikroschalters durch FTIR-Differenzspektroskopie

FTIR-Differenzspektroskopie an Rhodopsin

Die Meta-IIa und Meta-IIb-Zustände

In (Abb. 1) sind die Differenzspektren der Übergänge von Meta I nach Meta IIa und Meta IIb überlagert dargestellt (aufgenommen bei pH 8 und 30°C), da diese beiden Zustände immer gekoppelt auftreten.1) Allerdings wurden spezifische Differenzbanden für die Übergänge von Meta I zu Meta IIa (1.768cm-1 und 1.687cm-1) und von Meta IIa nach Meta IIb (u.a. 1.745cm-1 und 1.644cm-1) identifiziert2), so dass zumindest Aussagen über die prozentualen Anteile der beiden Spezies getroffen werden können. Deshalb wurde wieder die Methode der Doppeldifferenzen gewählt, um selbst kleinste Unterschiede identifizieren zu können, die beim direkten Vergleich der Differenzspektren verborgen blieben.

Abb.1
FTIR-Differenz- und Doppeldifferenzspektren von den Meta-IIa- und Meta-IIb-Zuständen

Oben ist das Differenzspektrum "Meta IIa/Meta IIb minus Dunkelzustand" des Wildtyps in schwarz dargestellt, die Differenzspektren der Mutanten in grau darunter. Farblich hervorgehoben sind die Doppeldifferenzspektren.

Man erkennt, dass Tyr223Ala nur sehr kleine Abweichungen im Amid-I-Bereich aufweist. Es kann somit von vornherein ausgeschlossen werden, dass das Tyr223 für einen dieser Übergänge unbedingt benötigt wird. Die Mutation Tyr223Phe hat sehr wohl Einfluss auf die Meta-IIb-Bildung: Die charakteristischen Banden treten, wenn überhaupt, nur minimal in Erscheinung. Auf der anderen Seite werden die Meta-IIa-Banden anscheinend nicht durch die Mutation beeinflusst. Das passt zu der Meinung vieler Wissenschaftler, dass der Meta-I-Meta-IIa-Übergang nur im Umfeld der Schiff'schen Base lokalisiert ist und sich nicht über das komplette Protein erstreckt. Dass die Tyr223Phe-Mutation den Meta-IIb-Übergang unterbindet, obwohl Tyr223 nicht für diesen Zustand notwendig ist, deutet die IMPB3)-Arbeitsgruppe so, dass die Phenylalanin-Seitenkette eine zusätzliche hydrophobe Interaktion (z.B. zu Helix 6) aufbaut und somit deren Auswärtsbewegung verhindert. Die Substitution durch die Glutaminsäure (Tyr223Glu) ruft sogar größere Differenzbanden hervor, als sie für den Wildtyp beobachtet werden. Dies spricht dafür, dass auch die Glutaminsäure-Seitenkette der Mutante, welche bei diesen Bedingungen ionisiert ist, andere Bindungen aufbaut als der Wildtyp.

Der Meta-IIbH+-Zustand

Es zeigt sich, dass der Glu134-Arg135-Tyr223-Mikroschalter erst am Übergang von Meta IIb zu Meta IIbH+ beteiligt ist. Alle vorgenommenen Mutationen haben sehr ähnliche Auswirkungen auf den Meta-IIbH+-Zustand ( (Abb. 2) ), was am besten an den intensiven Banden in den Doppeldifferenzspektren abzulesen ist. Dies bedeutet, dass keine der eingesetzten Aminosäuren die Rolle des Tyr223 übernehmen kann. Die besonderen Eigenschaften der Tyrosin-Seitenkette sind für das Erreichen des Meta-IIbH+-Zustandes notwendig.

Abb.2
FTIR-Differenz- und Doppeldifferenzspektren vom Meta-IIbH+-Zustand

Oben ist das Differenzspektrum "Meta IIbH+ minus Dunkelzustand" des Wildtyps in schwarz dargestellt, die Differenzspektren der Mutanten in grau darunter. Farblich hervorgehoben sind die Doppeldifferenzspektren.

1)Mahalingam, M.; Martínez-Mayorga, K.; Brown, M.; Vogel, R. (2008): . In: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 , 17795-17800
2)Zaitseva, E.; Brown, M.; Vogel, R. (2010): . In: J. Am. Chem. Soc.. 132 , 4815-4821
3)IMPB: Institut für Medizinische Physik und Biophysik der Berliner Charité
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