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Analyse eines Protein-Mikroschalters durch FTIR-Differenzspektroskopie

FTIR-Differenzspektroskopie an Rhodopsin

FTIR-Spektroskopie bietet die Möglichkeit, Aussagen über jeden einzelnen Meta-Zustand des Rhodopsins zu treffen. Um herauszufinden, an welchem Gleichgewicht der Mikroschalter Glu134-Arg135-Tyr223 teilnimmt, also wann dieser von inaktiv auf aktiv umschaltet, wurden veränderte Proteine exprimiert, welche eine andere Aminosäure anstelle des Tyrosins besitzen und ansonsten identisch sind. Funktioniert der Schalter nach einer Mutation nicht mehr, kann man daraus Rückschlüsse ziehen, wie wichtig die entsprechende Aminosäure ist und welche Art Bindung (z.B. polar, unpolar) eine Rolle spielt.

Eine nahe liegende Mutation ist Tyr223Phe (Y223F)1), weil diese dem Tyrosin sehr ähnlich ist: Es fehlt nur die Hydroxy-Gruppe. Allerdings ist es vorstellbar, dass der große, unpolare Phenyl-Ring des Phenylalanins in hydrophobe Wechselwirkung mit benachbarten Aminosäuren oder sogar anderen Proteinen tritt, an die das Tyrosin nicht bindet. Die Ergebnisse der Messung wären verfälscht. Deshalb wurden außerdem die Mutationen Tyr223Ala und Tyr223Glu untersucht: erstere, um überhaupt zu sehen ob und wann die Seitenkette für die Reaktion benötigt wird, letztere, um den Einfluss der Polarität des Tyrosins einzuordnen.

Der Meta-I-Zustand

(Abb. 1) zeigt die FTIR-Differenzspektren (grau) vom Rhodopsin-Wildtyp und den drei beschriebenen Mutationen. Zuerst wurden die Messbedingungen so gewählt, dass ein maximaler Anteil des Meta-I-Zustandes erhalten wurde (>98% bei pH 8,0°C). Man erkennt auf den ersten Blick keine Unterschiede zwischen dem Wildtyp und den mutierten Proteinen. Somit spielt Tyr223 beim Übergang in den Meta-I-Zustand offenbar keine Rolle.

Abb.1
FTIR-Differenz- und Doppeldifferenzspektren vom Meta-I-Zustand

Oben ist das Differenzspektrum "Meta-I-Zustand minus Dunkelzustand" des Wildtyps in schwarz dargestellt, die Differenzspektren der Mutanten in grau darunter. Farblich hervorgehoben sind die Doppeldifferenzspektren.

Um noch kleinere Unterschiede aufdecken zu können, als mit der Differenzspektroskopie sichtbar gemacht werden können, wurden die sogenannten Doppeldifferenzen berechnet: Dazu wurde das Differenzspektrum des Wildtyps (WT) vom Differenzspektrum der Mutante subtrahiert ( (Abb. 1) , rot, blau und grün). Dann erkennt man kleine Einflüsse in zwei Bereichen, oberhalb von 1.700cm-1 und um 1.236cm-1. Diese kleinen Unterschiede wurden als Interaktionen zwischen Tyr223 mit der Lipidmembran interpretiert, welche durch die Mutation verändert wurde. Für den Meta-I-Zustand spielen sie keine Rolle und sollen hier nicht weiter besprochen werden.

1)Die Schreibweise bedeutet, dass im Rhodopsin das Tyrosin an Position 223 durch ein Phenylalanin (Drei-Buchstaben-Code: Phe, Ein-Buchstaben-Code: F) ersetzt wurde.
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