zum Directory-modus

Analyse eines Protein-Mikroschalters durch FTIR-Differenzspektroskopie

Differenzspektroskopie

Die Differenzspektroskopie dient unter anderem dazu, kleinste Veränderungen zu verdeutlichen, die in Spektren von großen Molekülen mit vielen funktionellen Gruppen untergehen würden. Solche Spektren bestehen nämlich aus sehr vielen Banden, die sich zudem oft überlagern. Modifiziert man aber die Struktur eines solchen Makromoleküls und subtrahiert das IR-Spektrum nach der Veränderung von dem Spektrum vor der Veränderung, kann man sehr detaillierte Informationen darüber erhalten, an welchen Stellen sich das Molekül umgewandelt hat.

Beispiel

Betrachten wir das Absorptionsspektrum des Rhodopsins im Dunkelzustand ( (Abb. 1) , grün), erkennt man klar die Absorptionen in den Amid-I- und Amid-II-Bereichen zwischen 1.700 und 1.600cm-1 bzw. zwischen 1.560 und 1.520cm-1 oder vom Lösemittel (Wasser) bei 1.643cm-1.

Abb.1
Spektrum von Rhodopsin im inaktiven (grün) und im belichteten Zustand (rot) und das Differenzspektrum (blau)
Abb.2
Vergrößertes Differenzspektrum von Rhodopsin ("Photoprodukt minus Dunkelzustand")

Klicken Sie auf die Spektren, um sie zu vergrößern!

Belichtet man das Protein, isomerisiert das Chromophor 11-cis-Retinal, und in der Folge ändert sich die Konformation des Apoproteins. Das Absorptionsspektrum der belichteten Probe ( (Abb. 1) , rot - nur in der Vergrößerung zu erkennen) lässt auf den ersten Blick keine Rückschlüsse auf die geänderte Protein-Konformation zu, da die Absorptionsänderungen um drei Größenordnungen kleiner sind als die intensivsten Banden des Absorptionsspektrums. Es ist daher gebräuchlich beide Spektren voneinander zu subtrahieren, das sogenannte Differenzspektrum "Photoprodukt minus Dunkelzustand" zu berechnen ( (Abb. 1) , blau). In der Vergrößerung (Abb. 2) erkennt man diverse scharfe Differenzbanden, die durch die verschiedenen Absorptionen von Anfangs- und Endzustand hervorgerufen werden.

Zum besseren Verständnis soll die Aminosäure Glu122 aus Helix 3 näher betrachtet werden ( (Abb. 3) und (Abb. 4) ): Ihre Carboxy-Seitenkette ist in beiden Zuständen protoniert und absorbiert daher im Bereich zwischen 1.800 und 1.690cm-1. Die genaue Lage der Banden ergibt sich aus der Stärke der Delokalisierung des Protons und unterscheidet sich daher für ungebundene Carboxy-Seitenketten und solche, die Wasserstoff-Brückenbindungen aufweisen. Die negative Bande bei 1.727cm-1 liegt im Bereich von zwei Wasserstoff-Brückenbindungen, wohingegen die Bande bei 1.745cm-1 nur eine solche Bindung widerspiegelt (Abb. 2) .

Abb.3
Ausschnitt des Rhodopsins im Dunkelzustand

Die Carboxy-Seitenkette von Glu122 ist protoniert und bildet zwei Wasserstoff-Brückenbindungen zu benachbarten Gruppen.

Abb.4
Ausschnitt des aktivierten Rhodopsins

Die Carboxy-Seitenkette von Glu122 ist protoniert und bildet eine Wasserstoff-Brückenbindung.

Seite 6 von 10