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Die PCR in der Praxis

Die touchdown-PCR

Bei der touchdown-PCR (TD-PCR) wird durch eine hohe Annealing-Temperatur in den ersten Schritten der Synthese eine sehr hohe Spezifität der Primer-Bindung an das Template erzwungen. Dann wird diese Temperatur schrittweise gesenkt. Nun binden die Primer weniger spezifisch, aber es sind bereits mehr spezifische Template-Moleküle im Ansatz vorhanden. Die Menge der unspezifischen PCR-Produkte wird so erheblich reduziert.

Für jedes Primerpaar lässt sich eine optimale Bindungstemperatur (Annealing-Temperatur) für das komplementäre Substrat berechnen. Diese wird vor allem durch die Schmelztemperatur der beiden Primer bestimmt und lässt sich auf der Basis des GC/AT-Gehaltes schätzen. Die tatsächliche Schmelztemperatur hängt jedoch stark von der Zusammensetzung des jeweiligen Reaktionspuffers und sogar von der verwendeten Template-/Primer-Konzentration ab. Üblicherweise liegt die Annealing-Temperatur etwa 3 °C unter der Schmelztemperatur, also der Temperatur, bei der eine Bindung zwischen DNA und Primer nicht mehr gewährleistet ist.

Ist die Annealing-Temperatur zu niedrig, bindet der Primer unspezifisch an alle möglichen Template-Bereiche, ist die Temperatur zu hoch, bindet er gar nicht. Besonders bei der Amplifikation von Genen, die als Multigenfamilien vorliegen, von homologen Genbereichen eng verwandter Spezies oder wenn die Konzentration der Target-DNA im PCR-Ansatz sehr gering ist, treten oft störende Nebenbanden auf. Sie sind das Ergebnis unspezifischer Primer-Bindungen und vermehren sich in jedem weiteren PCR-Schritt. Anstatt die Schmelztemperatur in aufwändigen Versuchsreihen anzupassen, hilft oft eine touchdown-PCR, das Problem zu verringern.

Im ersten Schritt der Primer-Bindung wird eine Temperatur gewählt, die geringfügig über der berechneten Schmelztemperatur der Primer liegt. Unter diesen Bedingungen bindet der Primer nur dann, wenn er optimal passt - d.h. es entstehen praktisch keine Nebenprodukte aus unspezifischer Bindung des Primers an die DNA. In den darauf folgenden Zyklen wird die Temperatur schrittweise gesenkt, daher auch die Bezeichnung touchdown - wie bei der Landung eines Flugzeugs, das sich Schritt für Schritt der Landebahn annähert.

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Abb.1
Animation zum Temperaturprofil der touchdown-PCR

Tipps für die Praxis

In der Praxis wird der erste Annealing-Schritt bei einer Temperatur durchgeführt, die etwa 10 °C über der errechneten Schmelztemperatur des Primers liegt. In jedem weiteren Zyklusschritt wird diese Temperatur um 1 °C gesenkt, bis die errechnete Temperatur erreicht oder unterschritten ist (ca. 10-15 Zyklen), gefolgt von weiteren 20-25 Zyklen bei optimaler Temperatur. Besonders günstig ist es, diese Form der PCR mit einem hot start zu kombinieren und eine DNA-Polymerase zu wählen, die unterhalb ihres Temperaturoptimums nicht aktiv ist (hot-start-Polymerase).

Eine TD-PCR eignet sich nicht für Multiplex-Analysen, bei der verschiedene Proben in einem Ansatz parallel amplifiziert werden. Die Anzahl der Zyklen sollte nicht größer als 35 sein, da andernfalls die Bildung unspezifischer Produkte wieder gefördert wird. Als besonders hilfreich bei schwierigen Substraten hat sich ein einmaliger zusätzlicher Denaturierungsschritt für eine Minute bei 96-97 °C erwiesen (Don et al., 1991).

Literatur

Don, R. H.; Cox, P. T.; Wainwright, B. J.; Baker, K.; Mattick, J. S. (1991): 'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. In: Nucleic Acids Res.. 19 (14) , 4008
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