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Die PCR in der Praxis

Taq und andere Polymerasen

Die hitzestabile Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus wird auch heute noch für Standard-PCRs eingesetzt, aber das Enzym in seiner natürlichen Form hat einige Nachteile:

  • Das Enzym ist auch unterhalb seines Temperaturoptimums von 72 °C aktiv, so dass bei nicht optimalen Bedingungen Primer-Primer-Paare auftreten können. Verschiedene Firmen haben das Enzym daher optimiert. Heute sind chemisch modifizierte Taq-Polymerasen erhältlich, die speziell für einen hot start angepasst und bei Temperaturen unter 75 °C nicht aktiv sind.
  • Das ursprüngliche Enzym lässt die Synthese von Ketten mit mehr als 6000 Nucleotiden nicht zu. Auch in diesem Punkt wurde das Ausgangsenzym optimiert (z.B. Taq-Polymerasen für längere Amplifikate). Alternativ wird die Taq-Polymerase in Kombination mit einem weiteren Enzym eingesetzt (z.B. Tgo-Polymerasen), das bis zu 30 kb1) lange PCR-Produkte ermöglicht oder für die Synthese von DNA mit hohem GC2)-Gehalt besser geeignet ist.
  • Die Taq-Polymerase hat keine Korrekturfunktion (keine 3'-5'-Exonuclease-Aktivität) und kann daher Fehler beim Kopieren der DNA nicht ausbessern. Kopierfehler der Polymerase führen zu PCR-Produkten, die von der Template-DNA abweichen. Diese Mutationen sind unerwünscht, wenn die DNA z.B. für Klonierungszwecke verwendet wird. Andere thermostabile Polymerasen, wie der Pwo aus Pyrococcus woesei und der Pfu aus Pyrococcus furiosus, besitzen diesen Korrektur-Mechanismus und werden daher für bestimmte Anwendungen vorgezogen - oder in Kombination mit der Taq-Polymerase verwendet. Der Nachteil aller bekannten Polymerasen mit proofreading-Aktivität besteht allerdings darin, dass sie nicht in Kombination mit der Uracil-DNA-Glycosylase genutzt werden können, die einen carry-over-Effekt3) verhindert.
1)kb: Kilobasen
2)GC: Guanin-Cytosin
3)Verunreinigungen durch vorherige PCR-Ansätze.
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