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Die PCR in der Praxis

Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR)

Während bei den meisten PCR1)-Verfahren ein DNA-Molekül als Template eingesetzt wird, ist die RT-PCR eine Methode zur Amplifikation von einzel- oder auch doppelsträngigen RNA-Molekülen.

Hinweis
Die Abkürzung RT-PCR hat zwei Bedeutungen - Reverse-Transkriptase-PCR, bei der ein RNA-Molekül amplifiziert wird, oder real-time-PCR, bei der die Entstehung der PCR-Produkte in Echtzeit anhand der Fluoreszenz verfolgt werden kann.
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Abb.1
Anwendungsbeispiel Insulin

Eine zu geringe Insulin-Produktion führt zu Diabetes (PDB-Code: 9INS).

Mit RT-PCR können beispielsweise Genexpressionsmuster anhand der in einer Zelle vorhandenen mRNAs bestimmt werden. Das Expressionsmuster zeigt an, ob ein bestimmtes Gen zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Zelle besonders oft abgelesen wird und daher besonders viel des entsprechenden Proteins produziert wird.

Ein Beispiel verdeutlicht, warum das u.a. auch in der Medizin wichtig ist: Diabetes kann viele Ursachen haben, eine davon ist die unzureichende Produktion von Insulin in den β-Zellen der Bauchspeicheldrüse. Mit einer RT-PCR lässt sich direkt verfolgen, ob ein Medikament die Insulin-Produktion steigern kann oder nicht. Eine andere Anwendung ist der Nachweis von viraler RNA in der medizinischen Diagnostik - viele Krankheitserreger sind RNA-Viren mit einzel- oder doppelsträngiger RNA, so z.B. Influenza-Viren oder der AIDS-Erreger HIV.

Die in der PCR verwendeten Polymerasen sind DNA-Polymerasen, d.h. diese Enzyme erkennen nur DNA, nicht aber RNA als Substrat. Die RNA muss daher zunächst in DNA umgewandelt werden. Eine RT-PCR ist in zwei Schritte unterteilt:

  • Im ersten Schritt wird die RNA durch eine reverse Transkriptase in eine cDNA2) umgeschrieben.
  • Im zweiten Schritt schließt sich eine normale PCR an, in der die im ersten Schritt erzeugte cDNA als Template verwendet wird.

Es gibt auch die Möglichkeit, diese beiden Schritte räumlich und/oder zeitlich voneinander zu trennen. Die herkömmliche Methode ist es, erst reverse Transkriptase in das Reaktionsgemisch zu geben und später dieses Gemisch als Template in den PCR-Ansatz einzusetzen.

Bei einer anderen Methode wird die Tth-Polymerase (aus Thermus thermophilus) verwendet. Die Tth-Polymerase kann sowohl als reverse Transkriptase als auch als Polymerase arbeiten. Die Regulation übernehmen bestimmte Cofaktoren: In Anwesenheit von Mangan-Ionen zeigt die Tth-Polymerase die Aktivität einer reversen Transkriptase und in Anwesenheit von Magnesium-Ionen eine DNA-Polymerase-Aktivität. So kann man durch Zugabe der richtigen Cofaktoren die gesamte RT-PCR in einem Ansatz durchführen.

1)PCR: polymerase chain reaction
2)cDNA: komplementäre Desoxyribonucleinsäure
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