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Die PCR in der Praxis

Detektionsverfahren in der real-time-PCR

Abb.1
Verlauf einer PCR für drei verschiedene Produkte

Vor der Entwicklung der real-time-PCR waren PCR-Verfahren mehr oder weniger begrenzt auf eine Endpunktbestimmung. Die Reaktion fand im Wasserbad oder im Thermoblock statt, am Ende wurde eine kleine Menge aus dem PCR-Ansatz entnommen und analysiert. Die Detektion der unmarkierten Produkte erfolgte meistens gelelektrophoretisch oder über die Sequenzierung des PCR-Produktes. Noch war es nicht möglich, die Menge an Produkt mit der Menge an eingesetzter Template-DNA in irgendeine Beziehung zu bringen.

Eine PCR beginnt langsam, geht dann in eine exponentielle Phase über und endet in einer Plateau-Phase. Der zum Ende der Reaktion auftretende Mangel an Substrat sowie das Auftreten von Abfall- und unerwünschten Nebenprodukten sind nur drei von vielen Faktoren, die eine PCR zum Erliegen bringen können.

Im Gegensatz zur Endpunktbestimmung ermöglicht die real-time-PCR, die exponentielle Phase der Reaktion in Echtzeit zu verfolgen. Dazu sind bestimmte Sonden erforderlich, die Licht in Abhängigkeit von der jeweiligen Produktmenge aussenden, und entsprechende Geräte (z.B. der LightCycler), die dieses Licht während der Reaktion kontinuierlich messen. Mit parallel zur Probe durchgeführten Standard-PCRs lässt sich zurückrechnen, mit wie vielen Kopien an Template-DNA die Reaktion begonnen wurde.

Sonden für die real-time-PCR

In der real-time-PCR werden grundsätzlich zwei Arten von Sonden verwendet: DNA-bindende Farbstoffe, die bei Bindung an doppelsträngige DNA stärker fluoreszieren, oder Farbstoffe auf der Basis von Rezeptor-/Quencherkombinationen (FRET-Sonden).

1. Interkalierende Fluoreszenzfarbstoffe

Farbstoffe wie Ethidiumbromid oder SYBR Green I lagern sich in die DNA ein. Dabei ändert sich ihr Absorptionsspektrum und die Fluoreszenz nimmt zu. Die Zunahme an Fluoreszenz korreliert demnach mit der Zunahme an doppelsträngigem DNA-Produkt pro Zyklus. Diese Methode ist billig, einfach, aber auch ungenau, weil zwischen verschiedenen DNA-Produkten nicht unterschieden werden kann.

2. FRET-Sonden

Diese Methode basiert auf dem fluorescence resonance energy transfer (FRET), dem Übergang eines Photons von einem Donor- auf ein Akzeptormolekül. Ein Donor-Fluoreszenzfarbstoff (der Reporter) wird durch eine Lichtquelle angeregt und gibt diese Energie an den Akzeptor ab, sofern dieser Akzeptor (auch Quencher genannt) nur nah genug ist. Die Stärke des Fluoreszenzsignals des Akzeptors nimmt mit dem Abstand zwischen Donor und Akzeptor ab. Bei der PCR werden daher kleine Oligonucleotide eingesetzt, die nebeneinander an die Ziel-DNA binden und mit verschiedenen FRET-Donoren bzw. -Akzeptoren markiert sind, so dass zunächst kein detektierbares Lichtsignal auftritt.

Wenn im Verlauf der PCR das PCR-Produkt synthetisiert wird, kommt es zu einer Trennung von Donor und Akzeptor. Die Energie des Donors kann nicht mehr auf den Akzeptor übertragen werden und wird als Lichtsignal abgegeben. Das Signal lässt sich am Ende jeder Elongationsphase im LightCycler messen. Diese Detektionsmethode ist teurer, aufwändiger, aber dafür hochspezifisch.

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