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Die PCR in der Praxis

Detektion von PCR-Produkten in der real-time-PCR

Die real-time-PCR, abgekürzt RT-PCR oder qRT-PCR (quantitative real-time-PCR) - nicht zu verwechseln mit der (quantitativen) Reverse-Transkriptase-PCR, die ebenfalls so abgekürzt wird -, ist eine PCR-Methode, bei der während der exponentiellen Phase der Reaktion in Echtzeit die Menge an Produkten über Fluoreszenz bestimmt werden kann. Bei einer PCR ohne Fluoreszenzfarbstoffe kann erst am Ende der Reaktion die Produktmenge bestimmt werden - also lediglich eine Endpunktbestimmung.

Geräte für die real-time-PCR und das Detektionsprinzip

PCR-Geräte sind alle grundsätzlich Thermocycler, bei denen sich ein bestimmtes Temperaturprofil einprogrammieren lässt, und bei fast allen modernen Geräten handelt es sich um so genannte LightCycler. Diese LightCycler erlauben eine Echtzeit- oder real-time-PCR, bei denen der Reaktionsverlauf über eine Lichtemission von Fluoreszenzsonden verfolgt werden kann.

Für diese Technik sind neben den beiden üblichen PCR-Primern eine oder zwei zusätzliche Hybridisierungssonden notwendig, die sequenzspezifisch an die PCR-Produkte binden und mit zwei oder (bei der Multiplex-PCR) auch mehreren verschiedenen Fluorochromen markiert sind. Sind diese Fluorochrome in räumlicher Nähe zueinander, z.B. am Anfang der PCR, gibt es kein Fluoreszenzsignal.

Werden diese beiden Fluorochrome aber im Verlauf der PCR-Amplifikation getrennt, wird Licht einer bestimmten Wellenlänge emittiert. Diese Lichtemission kann während des Versuchs verfolgt werden und ermöglicht Rückschlüsse auf die Konzentration des Ausgangsproduktes im PCR-Ansatz im Vergleich zu einem Standard.

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