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Die PCR in der Praxis

Die Weiterentwicklung der PCR zur real-time-PCR

Bei einer real-time-PCR (RT-PCR - nicht zu verwechseln mit der Reverse-Transkriptase-PCR, die ebenfalls mit RT-PCR abgekürzt wird) kann bereits während der PCR die Menge an neu gebildetem Produkt über die Zunahme der Fluoreszenz verfolgt werden. Mit diesem Verfahren eröffneten sich völlig neuartige Anwendungsbereiche für PCR-Analysen.

Als die ersten PCRs durchgeführt wurden (Kleppe et al., 1971), waren Oligonucleotide noch teuer in der Herstellung und thermostabile DNA-Polymerase nicht bekannt, ganz abgesehen davon, dass für jeden Schritt die Probe per Hand in ein Wasserbad mit entsprechender Temperatur umgesetzt wurde. Zehn Jahre später gab es zwar entsprechende Geräte, aber nach jedem Zyklus musste noch immer aktive Polymerase für den nächsten Zyklus zugefügt werden (Saiki et al., 1985). Dank der modernen Thermocycler laufen heute alle Prozesse automatisch ab.

Auch im Hinblick auf die Analyse des Produktes hat sich viel getan. Eine grobe Abschätzung der Produkte in Bezug auf Reinheit (ein oder mehrere Produkte) bzw. Größe des gesuchten PCR-Produktes erlaubte damals wie heute die Gelelektrophorese. Ist eine abgegrenzte Bande im Agarose- oder Polyacrylamid-Gel zu sehen, und hat diese DNA auch noch die berechnete molekulare Masse, dann war die PCR mit einiger Sicherheit erfolgreich. PCR-Produkte konnten damals noch nicht mit Farbstoffen markiert werden, so dass der Erfolg einer PCR nur anhand einer Endpunktbestimmung kontrolliert werden konnte.

Für viele moderne PCR-Anwendungen reicht die Größenbestimmung des Produktes im Gel heute nicht mehr aus, wenn z.B. nur eine Base ausgetauscht worden ist und das Produkt der PCR damit anhand der Größe nicht unterschieden werden kann. In diesem Fall müsste sich an die PCR eine Sequenzierung des Produktes anschließen - oder eine real-time-PCR.

Moderne PCR-Verfahren

Der große Vorteil der real-time-PCR liegt darin, dass mit dem zeitgleichen Verfolgen der PCR schon im Vorfeld eine Aussage möglich ist, ob die PCR erfolgreich war oder nicht. Higuchi und Mitarbeiter waren die Ersten, die Ethidiumbromid mit in den PCR-Ansatz gaben und die Akkumulation des Produktes in Echtzeit bestimmten. Ethidiumbromid interkaliert in doppelsträngige DNA. Diese Eigenschaft war schon lange bekannt und wurde schon seit vielen Jahren bei der Färbung von DNA-Molekülen in Agarose-Gelen verwendet. Aber Ethidiumbromid ist nur bedingt für Nachweiszwecke geeignet, denn der Farbstoff interkaliert in jede, d.h. auch unspezifische DNA oder in Primer-Primer-Paare. Heute existieren andere, besser geeignete Farbstoffe, um den Verlauf einer PCR zu verfolgen.

Abb.1
Ethidiumbromid als Einlagerungskomplex mit der doppelsträngigen DNA.

Abb. nach D. Voet, J.G. Voet: Biochemie

Ein weiterer Vorteil ist, dass bei der real-time-PCR das Reaktionsgefäß nicht geöffnet werden muss, was die Gefahr der Kontamination im Arbeitsbereich reduziert. Der größte Vorteil dieser Methode ist aber vermutlich, dass die Menge an Produkt direkt mit der Menge an eingesetzter DNA korreliert und daher Rückschlüsse auf die Anfangskonzentration des Templates erlaubt. Auch dieses war bei älteren PCR-Methoden nicht möglich.

Literatur

Kleppe, K.; Ohtsuka, E.; Kleppe, R.; Molineux, I.; Khorana, H. G. (1971): Studies on polynucleotides: XCVI. Repair replication of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases. In: J. Mol. Biol.. 56 , 341-61
Saiki, R. K.; Scharf, S.; Faloona, F.; Mullis, K. B.; Horn, G. T.; Erlich, H. A.; Arnheim, N. (1985): Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. In: Science. 230 , 1350-4
Higuchi, R.; Dollinger, G.; Walsh, P. S.; Griffith, R. (1992): Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. In: Biotechnology (N Y). 10 , 413-7
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