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Die PCR in der Praxis

NASBA1) zur Identifikation von RNA

Die PCR mit RNA als Template

In den meisten Fällen wird bei der PCR2) ein DNA-Molekül als Template eingesetzt. Aber auch RNA-Moleküle lassen sich - allerdings mit einem DNA-Zwischenschritt - in einer PCR vermehren. Das ist vor allem in der Diagnostik eine wichtige Anwendung, wenn z.B. eine Infektion mit einem RNA-Virus nachgewiesen werden soll. Viren mit RNA als Genom verursachen viele für den Menschen bedrohliche Erkrankungen, so beispielsweise AIDS3), Influenza, Ebola, Tollwut oder SARS4).

Neben der RT5)-PCR ist auch die nucleic acid sequence based amplification (NASBA) eine geeignete Methode zur Amplifikation von RNA.

Mit der NASBA kann genomische, ribosomale oder Messenger-RNA auf einem DNA-Hintergrund amplifiziert werden, allerdings sind dazu mindestens 400 Kopien/mL Plasma erforderlich. Die NASBA ist ein isothermes PCR-Verfahren, d.h. dass es bei diesem Verfahren keinen Denaturierungs- bzw. Strangtrennnungsschritt gibt, die Temperatur bleibt während der Synthese (üblicherweise 90 Minuten) bei ca. 41 °C. Auf den Denaturierungsschritt kann verzichtet werden, weil im Verlauf der PCR keine doppelsträngigen DNA-Moleküle getrennt werden müssen.

Die Amplifikation verläuft ähnlich wie die Virus-Replikation, erforderlich ist dazu ein Primer mit einem T7-RNA-Polymerase-Promotor. Im ersten Schritt, der nicht zyklischen Phase, wird die RNA durch das Enzym reverse Transkriptase in DNA übersetzt und der zweite DNA-Strang dazu synthetisiert. Dann wird eine antisense-RNA synthetisiert und diese im nun folgenden zyklischen Prozess amplifiziert. Das Produkt ist also eine einzelsträngige RNA in entgegengesetzter Richtung zur Ausgangs-RNA (Antisense-RNA).

Literatur

Boom, R.; Sol, C. J.; Salimans, M. M.; Jansen, C. L.; Wertheim-van Dillen, P. M.; van der Noordaa, J. (1990): Rapid and simple method for purification of nucleic acids. In: J. Clin. Microbiol. . 28 , 495-503
Titel des Artikels
Rapid and simple method for purification of nucleic acids
Abstract
We have developed a simple, rapid, and reliable protocol for the small-scale purification of DNA and RNA from, e.g., human serum and urine. The method is based on the lysing and nuclease-inactivating properties of the chaotropic agent guanidinium thiocyanate together with the nucleic acid-binding properties of silica particles or diatoms in the presence of this agent. By using size-fractionated silica particles, nucleic acids (covalently closed circular, relaxed circular, and linear double-stranded DNA; single-stranded DNA; and rRNA) could be purified from 12 different specimens in less than 1 h and were recovered in the initial reaction vessel. Purified DNA (although significantly sheared) was a good substrate for restriction endonucleases and DNA ligase and was recovered with high yields (usually over 50%) from the picogram to the microgram level. Copurified rRNA was recovered almost undegraded. Substituting size-fractionated silica particles for diatoms (the fossilized cell walls of unicellular algae) allowed for the purification of microgram amounts of genomic DNA, plasmid DNA, and rRNA from cell-rich sources, as exemplified for pathogenic gram-negative bacteria. In this paper, we show representative experiments illustrating some characteristics of the procedure which may have wide application in clinical microbiology.
2)PCR: polymerase chain reaction
3)AIDS: acquired immune deficiency syndrome
4)SARS: severe acute respiratory syndrome
5)RT: reverse Transkriptase
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