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Die PCR in der Praxis

Andere Sonden für die real-time-PCR

Bei der so genannten beacon-Sonde1) liegen Quencher- und Reporter-Farbstoff zunächst in einem in sich selbst zurückgefalteten DNA-Molekül wie in einer Haarnadelschleife (engl. loop) nebeneinander. Der doppelsträngige Stamm dieses Moleküls besteht aus 5-7 zueinander komplementären Basen (die entsprechend aneinander binden können), gefolgt von einer einzelsträngigen Schleife (loop) von 18-30 Nucleotiden, die zur Target-DNA komplementär sein müssen. Für Schleifenbereiche von 25 Nucleotiden reicht ein Stamm von 6 Nucleotiden, bei längeren loops sind mindestens sieben Nucleotide für eine ausreichende Stabilität notwendig.

Die Stabilität und die gewünschte Sekundärstruktur eines molecular-beacon-Primers muss vor dem Experiment überprüft werden (auch im Hinblick darauf, ob noch andere Sekundärstrukturen gebildet werden können), z.B. in der Datenbank MFOLD. Die beiden Farbstoff-Moleküle sind am 3'- und am 5'-Ende kovalent angeheftet und zeigen zunächst (d.h. in der gefalteten Form) keine messbare Fluoreszenz. Sobald die Sonde an das komplementäre DNA-Target bindet, werden Reporter- und Quencher-Farbstoff voneinander getrennt, so dass ein messbares Signal entsteht. Für diese Anwendung gebräuchliche Fluoreszenzlabels sind zahlreich, aber als Quencher werden fast immer Dabcyl oder Dabsyl verwendet.

Strukturformeln von Fluoreszenzlabels und Quenchern

Entsteht nun im Verlauf der PCR ein komplementäres, einzelsträngiges DNA-Molekül, wird die molecular-beacon-Sonde aufgefaltet und bindet nun bevorzugt an diese neue Sequenz, zu der es 100%ig passt. Dabei werden Reporter- und Quencher-Farbstoff voneinander getrennt, mit dem Ergebnis, dass der Reporter-Farbstoff nun fluoresziert. Die Menge der Fluoreszenz ist direkt proportional zur Menge an spezifischem PCR-Produkt und wird im LightCycler bestimmt.

Diese Methode eignet sich für den Nachweis von SNPs, bestimmten Allelen, für die Multiplex-PCR und für klinisch-diagnostische Zwecke.

Abb.1
Die molecular-beacon-Sonde
1)beacon engl. "Leuchtfeuer, Lichtsignal"
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