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Die PCR in der Praxis

FRET-Sonden für den Nuclease-Assay

Der 5'-Nuclease-Assay basiert auf einer doppelt markierten FRET1)-Probe und der Verwendung der Taq-Polymerase. Dieses Enzym hat eine 5'-3'-Exonuklease-Aktivität und baut daher im Verlauf des Geschehens die FRET-Probe ab. Dabei wird das Fluorochrom des 5'-Endes freigesetzt und kann dann gemessen werden. Die Lichtemission dieses freigesetzten Fluorochroms wird über die Zeit verfolgt und ermöglicht so, den Verlauf einer PCR darzustellen.

Das eine FRET-Fluorochrom ist am 5'-Ende der Probe lokalisiert (der Receiver oder Donor), der andere Partner (Quencher oder Akzeptor) nahe dem oder am 3'-Ende. Der optimale Abstand der beiden FRET-Partner in der Probe hängt davon ab, welches Farbstoff-Paar verwendet wird, und beträgt in der Regel etwa 6 Nucleotide. Dieser Abstand wird durch die Windung der DNA und die Ausrichtung der beiden Farbstoff-Moleküle bedingt. Die Probe ist zudem am 3'-Ende geschützt, so dass die Taq-Polymerase dieses Ende nicht als Substrat erkennt. Zu diesem Zweck reicht in der Regel ein Phosphat-Rest aus, aber auch andere Blocker-Substanzen können hier verwendet werden. Die Taq-Polymerase beginnt die Polymerisationsreaktion an einem 3'-Ende eines vorherigen Primers und baut die FRET-Probe vom 5'-Ende her ab.

Der Nachteil dieser Methode liegt darin, dass man neben den geeigneten Primern auch eine passende Probe braucht, die gewissen Beschränkungen unterliegt. Um sicherzustellen, dass das 5'-Ende der Probe wirklich für die Taq-Polymerase als Substrat zugänglich ist, sollte die Probe so beschaffen sein, dass die Schmelztemperatur 5-10 °C über der Schmelztemperatur der Primer liegt. Bei einer sehr AT-reichen DNA ist das unter Umständen extrem schwierig.

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Abb.1
Nuclease-Assay

Ein typisches Beispiel ist die TaqMan®-Probe, die am 5'-Ende z.B. mit dem grün fluoreszierenden Protein (green fluorescent protein, GFP) markiert ist. Das 3'-Ende der Probe trägt den Quencher, der in der Regel im langwelligen, roten Bereich absorbiert. Wenn die Probe mit seinen beiden Fluorophoren an das DNA-Template gebunden hat und eine Polymerase mit Exonuclease-Aktivität, die Taq-Polymerase, bei der Kettenverlängerung die Probe am DNA-Template sukzessive ersetzt, wird der Reporter-Farbstoff am 5'-Ende abgespalten. Die Lichtemission des Reporter-Farbstoffes wird nicht mehr vom Quencher aufgenommen und kann nun im LightCycler detektiert werden.

Literatur

(2004): Real-time PCR. In: An essential guide. Kirstin Edwards Julie Logan Nick Saunders (Hrsg.). Horizon Bioscience
1)FRET: Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer
Seite 18 von 22