zum Directory-modus

Die PCR in der Praxis

Methoden

Abb.1
Das gewonnene DNA-Material reicht oft nur für wenige PCR-Ansätze

Der Begriff Polymerase-Kettenreaktion (PCR) umfasst mittlerweile eine Vielzahl an unterschiedlichen PCR-Verfahren, die entwickelt wurden, um bestimmte methodische Probleme zu umgehen. In den seltensten Fällen kann eine PCR unter optimalen Bedingungen durchgeführt werden, d.h. mit hochreinem, homogenem DNA-Material in ausreichender Menge. Ist aber nur wenig einer unbekannten Template-DNA für die PCR verfügbar (z.B. aus fossilen Proben), und ist dieses Material ziemlich sicher im Verlauf der Lagerung und/oder des Isolierungsprozesses beschädigt bzw. kontaminiert worden, gibt es eine Reihe methodischer Kniffe, mit denen das Ergebnis einer PCR positiv beeinflusst werden kann.

Verfahren, die die PCR positiv beeinflussen

  • Anwendung der touchdown-PCR, bei der die Temperatur für die Anlagerung des Primers an das Template - eine Temperatur, die geringfügig über der berechneten Schmelztemperatur liegt - stufenweise gesenkt wird. Dies gewährleistet innerhalb eines vorgegebenen Bereichs die höchstmögliche Anfangstemperatur für eine spezifische Primer-Bindung und entsprechend auch eine hohe Spezifität der PCR-Produkte.
  • Verlängerung der letzten Synthesephase in der Prolongations-PCR, um die Ausbeute zu erhöhen.
  • Vermeidung zu geringer Annealing-Temperaturen während der Aufheizphase durch Einsatz der hot-start-PCR reduziert Produkt-Artefakte.
  • Doppelte Nutzung desselben Templates in der nested-PCR steigert die Spezifität.
  • Verwendung einzelsträngiger RNA als Template in der Reverse-Transkriptase-PCR, die in DNA umgeschrieben wird (wenn keine DNA zur Verfügung steht oder das Muster der Genexpression analysiert werden soll).
  • Bestimmung der Zunahme eines PCR-Produktes in der real-time-PCR (RT-PCR) in Echtzeit erlaubt eine Aussage über die Menge an Ausgangs-DNA im PCR-Ansatz.
Seite 3 von 22