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Die PCR in der Praxis

Der LightCycler

LightCycler sind Geräte, die kontinuierliche Messungen der Fluoreszenz in einer Probe während aller Temperaturzyklen einer PCR zulässt. Die Reaktion findet in Glaskapillaren statt, die sich in einer Art "Karussell" befinden und durch die Rotation dieses Karussells sukzessive an einer Lichtdetektionsvorrichtung vorbeigeführt werden. Die Temperaturzyklen werden über heiße Luft erzeugt - in der ersten Version eines LightCyclers (LightCycler-24, Idaho Techology) wurde zu diesem Zweck sogar noch ein Heißluftfön verwendet.

Das erste Patent für dieses Gerät (1997) hielt die Firma Roche, die seit 1998 LightCycler anbieten, die eine PCR in 15-30 Minuten ermöglichen. In der Folge wurde das Gerät um das LC480-System erweitert, mit dem auch Mikrotiterplatten verwendet werden können. So lässt sich eine enorm hohe Anzahl an Proben in relativ kurzer Zeit analysieren. Heute bieten zahlreiche Firmen ähnliche Geräte an.

Im LightCycler befinden sich die Proben in kleinen Glaskapillaren mit einem Fassungsvermögen von z.B. 20-100 μL (für Multiplex-PCR-Analysen). Die Probe wird in die Kapillare eingebracht und die Kapillare verschlossen, kurz zentrifugiert und in das Karussell eingesetzt. Dieses Karussell bewegt die Probe an einer Linse entlang, die monochromes blaues Licht mit einer Wellenlänge von 470 nm abgibt und das von der Probe emittierte Licht misst.

Möglichkeiten der Anwendung

Mit den Instrumenten zur Durchführung einer real-time-PCR verbunden ist eine Software, die in der Regel drei Arten von Analysen ermöglicht:

  • Bestimmung der Anzahl der PCR-Zyklen über die Zunahme an Fluoreszenz,
  • Berechnung der Anzahl der ursprünglich eingesetzten Template-Moleküle im Vergleich mit einem externen Standard und
  • Aufnahme von Schmelzkurven zur Berechnung des Schmelzpunktes einer DNA.
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