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Die PCR in der Praxis

Die hot-start-PCR

Bei der hot-start-PCR (Heißstart-PCR) beginnt die Polymerisation erst, wenn das Reaktionsgemisch die gewünschte Mindesttemperatur erreicht hat, um die Spezifität der Reaktion zu steigern.

Mit diesem Verfahren wird sichergestellt, dass die Polymerisation erst beginnt, wenn die Primer spezifisch an die DNA-Sequenz gebunden haben: es entstehen weniger unspezifische Nebenprodukte. Vor der Automatisierung der PCR-Prozesse wurde für einen hot start die DNA-Polymerase erst nach dem Erreichen der Schmelztemperatur der DNA zum Ansatz hinzugegeben. Das hat allerdings einige Nachteile: da die Polymerase per Hand nacheinander zu vielen Proben pipettiert wird, starten die Reaktionen nicht mehr zeitgleich. Zudem kann es durch das Öffnen des Reaktionsgefäßes zu Verunreinigungen kommen.

Eine Verbesserung dieser Methode wurde durch eine Wachsschicht auf dem Ansatz erreicht. Template, Puffer, dNTPs, Primer und Zusatzstoffe werden in das Reaktionsgefäß pipettiert, dann folgt ein Wachskügelchen definierter Zusammensetzung, das beim ersten Erhitzen schmilzt und die unvollständige Reaktionsmixtur versiegelt. Auf diese Wachsschicht wird nun die Polymerase gegeben, die sich beim nächsten Erhitzen des Wachses mit dem Rest des wässrigen Reaktionsansatzes vermischt. So lassen sich alle Reaktionsansätze gleichzeitig starten. Durch die definierten chemischen Eigenschaften des Wachses wird die PCR nicht beeinträchtigt.

Als Drittes kann ein verzögerter Reaktionsstart auch durch den Zusatz von Antikörpern erreicht werden. Hier wird eine DNA-Polymerase verwendet, die an Antikörper gebunden ist, die die Polymerase-Aktivität bei normaler Umgebungstemperatur hemmen. Bei dem ersten Erhitzungsschritt denaturieren die temperaturempfindlichen Antikörper, die Polymerase wird aktiv und beginnt mit der Polymerisierungsreaktion.

Die Vorteile der hot-start-Methode sind:

  • weniger unspezifische Nebenprodukte
  • die Polymerase-Reaktion beginnt erst, wenn die DNA vollständig geschmolzen ist
  • die Primer binden aufgrund der hohen Temperatur spezifisch an die DNA
  • die Dimerisierung der Primer wird durch die hohen Temperaturen verhindert

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Abb.1
Animation zum Temperaturprofil der hot-start-PCR
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