zum Directory-modus

Die PCR in der Praxis

FRET-Sonden

Im FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer, nach Theodor Förster auch Förster-Resonanz-Energietransfer) wird Energie von einem angeregten Farbstoff, dem Donor, auf einen zweiten Farbstoff, den Akzeptor, übertragen. Zu diesem Zweck müssen Donor und Akzeptor allerdings in einer gewissen räumlichen Nähe zueinander angeordnet sein.

Bei FRET-basierten PCR-Verfahren werden daher kurze Oligonucleotide verwendet, die entweder zwei Farbstoff-Marker in einer kurzen DNA-Probe besitzen, oder zwei Moleküle mit je einem Marker. Ein typischer Donor-Farbstoff ist das grün fluoreszierende Fluorescein, ein geeigneter Akzeptor ist das rot fluoreszierende Rhodamin.

Abb.1
Fluorescein
Abb.2
Rhodamin B
Abb.3
Rhodamin 6G

Weitere Donor/Akzeptor-Paare für FRET-Sonden und ihre Eigenschaften

FRET-Hybridisierungssonden und ihre Anwendung für eine PCR im LightCyler

Abb.4
Nuclease-Assay

Eine FRET-geeignete Hybridisierungssonde (Probe) besteht aus einem kurzen einzelsträngigen DNA-Oligonucleotidstrang, der jeweils mit zwei verschiedenen Farbstoffen markiert ist: dem Reporter-Farbstoff am 5'-Ende (Donor) und dem Akzeptor oder Quencher am 3'-Ende. Diese beiden Farbstoffe sollten im Idealfall einen Abstand von maximal 4-6 nm aufweisen, denn oberhalb von 6 nm sinkt die Effizienz des Energietransfers exponentiell ab.

Über FRET wird die Lichtemission des Reporter-Farbstoffs durch den Quencher-Farbstoff inhibiert - das funktioniert aber nur, wenn beide Farbstoffe wie in der kurzen DNA-Probe in unmittelbarer Nachbarschaft zueinander sind, z.B. in einem Abstand von 5-7 Nucleotiden zueinander.

Wird die PCR-Polymerisationsreaktion nun mit einer DNA-Polymerase durchgeführt, die wie die Taq-Polymerase eine 5'-3'-Exonuclease-Aktivität aufweist, spaltet die Polymerase im Verlauf der Kettenverlängerung das 5'-Ende der Probe samt des Donors ab und ersetzt diese Nucleotide entsprechend.

Durch die räumliche Trennung des Donors vom Akzeptor unterbleibt der Energietransfer auf den Akzeptor oder Quencher. Der freigesetzte Reporter-Farbstoff in Lösung emittiert nun Licht, das im PCR-Gerät (z.B. dem LightCycler) detektierbar ist und als Maß für eine erfolgreiche Polymerisationsreaktion bestimmt wird.

Literatur

(2004): Real-time PCR. In: An essential guide. Kirstin Edwards Julie Logan Nick Saunders (Hrsg.). Horizon Bioscience
Seite 16 von 22