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Die PCR in der Praxis

Der Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green

Abb.1
SYBR Green I

SYBR Green wurde erstmalig 1995 auf den Markt gebracht, als DNA-Farbstoff für die Gelelektrophorese. Der grünliche Farbstoff ähnelt dem Fluoreszenz-Farbstoff Fluorescein in Bezug auf seine Spektraleigenschaften und hat eine hohe Affinität zu doppelsträngiger DNA1), in die er sich wie Ethidiumbromid einlagern kann. Heute wird er vor allem für die real-time-PCR2) eingesetzt. Wird in jedem PCR-Zyklus die SYBR-Green-Konzentration einmal bestimmt, lässt sich die Zunahme an PCR-Produkt sehr einfach optisch in Echtzeit verfolgen.

Während der Phase der Temperaturerhöhung werden die beiden komplementären DNA-Moleküle getrennt und die Fluoreszenz sinkt praktisch auf null. Während der sich dann anschließenden Abkühlungsphase bindet der Primer an sein DNA-Template, dann beginnt die DNA-Polymerase mit der Synthese des neuen Stranges. Mit der Zunahme an doppelsträngiger DNA im Ansatz steigt die Fluoreszenz an, da zunehmend mehr SYBR Green eingelagert wird.

Der Nachteil dieser Methode ist, dass SYBR Green unspezifisch an jede DNA bindet, auch an Primer-Primer-Paare oder unspezifische PCR-Produkte.

Durch Beobachtung der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Temperatur lässt sich der Schmelzpunkt der gebildeten DNA bestimmen: Erreicht die Fluoreszenz bei Temperatur X ein Minimum, haben sich die beiden DNA-Stränge getrennt und es ist kein SYBR Green mehr eingelagert. Dieses Verfahren ist zur Identifizierung des Produktes ebenso gut geeignet wie die Gelelektrophorese, die sich sonst oft anschließen würde. Auch Multiplex-Analysen lassen sich mit SYBR Green durchführen, sofern die verschiedenen Produkte auf der Basis ihrer jeweiligen Schmelztemperaturen unterschieden werden können.

1)DNA: Desoxyribonucleinsäure
2)PCR: polymerase chain reaction
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