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Die PCR in der Praxis

Optimierung der PCR mit dUTP und Uracil-N-Glycosylase

Die Verunreinigung eines PCR-Ansatzes durch zuvor im gleichen Gerät und mit gleichen Puffern etc. amplifizierten Proben ist ein großes Problem. Besonders in Laboratorien, die immer wieder den gleichen Erreger nachweisen (z.B. in der medizinischen Diagnostik), lässt sich nicht unterscheiden, ob das neue PCR-Produkt eventuell doch aus einer vorherigen PCR stammt (carry-over-Kontamination).

Diese Verunreinigungen und entsprechend falsch-positive Ergebnisse bei nachfolgenden PCRs lassen sich relativ einfach durch den Zusatz von dUTP1) statt dTTP2) und des Enzyms Uracil-N-Glycosylase bei einer hot-start-PCR verhindern.

Die Uracil-N-Glycosylase ist ein Reparaturenzym und entfernt Uracil-Reste aus der DNA. Uracil-Reste entstehen beispielsweise spontan, wenn Cytosin durch die Einwirkung bestimmter Chemikalien oder durch UV-Strahlung oxidativ desaminiert wird. Die Desaminierung von Cytosin zu Uracil kann in der DNA zu Mutationen (Austausch eines GC-Paares gegen ein AT-Paar) führen, daher ist dieses Reparaturenzym in der Zelle sehr wichtig. Eine DNA mit fehlenden Basen ist bei höherer Temperatur nicht mehr stabil und wird enzymatisch abgebaut.

Der carry-over-Effekt wird durch dUTP und Uracil-N-Glycosylase verhindert

Bei dieser Methode ist das Nucleotid dTTP teilweise durch dUTP ersetzt, das von der DNA-Polymerase auch in die DNA eingebaut wird, allerdings weniger effizient. Daher ist das Mischungsverhältnis zwischen dTTP und dUTP für den Erfolg der PCR entscheidend - und wird dementsprechend von den meisten Firmen, die eine Nucleotidmischung anbieten, nicht genau angegeben. Alternativ wird ein Nucleotidmix verwendet, in dem die dUTP-Konzentration etwa dreifach höher ist als die Konzentration der anderen Nucleotide dATP, dCTP und dGTP.

Dem PCR-Ansatz wird zudem das Reparaturenzym Uracil-N-Glycosylase (UNG, auch Uracil-DNA-Glycosylase oder UDG genannt) zugesetzt.

Vor dem Beginn einer neuen PCR wird der PCR-Ansatz für zwei Minuten auf 50 °C erhitzt. Die Uracil-N-Glycosylase entfernt in diesem Schritt alle Uracil-Reste aus DNA-Molekülen, die in einer vorherigen PCR synthetisiert wurden und als Kontamination mit in das Reaktionsansatz gelangt sind. Im nun folgenden Erhitzungsschritt der hot-start-PCR (15 Minuten bei 95 °C) wird die UNG inaktiviert und das Phosphat-Rückgrat der kontaminierenden Moleküle an den Stellen, die keine Base mehr enthalten, gespalten. Dieser Schritt der Enzym-Denaturierung ist sehr wichtig, da andernfalls die Uracil-Glycosylase auch das neu synthetisierte PCR-Produkt gleich wieder abbauen würde.

Die PCR mit dUTP anstatt dTTP im Ansatz lässt sich nur mit DNA-Polymerasen durchführen, die keine proofreading-Aktivität haben. Polymerasen mit dieser Korrekturfunktion erkennen die falsche Base und schneiden diese während der Synthese wieder heraus.

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Abb.1
dTTP und dUTP

R = CH3: 2'-Desoxythymidin-5'-triphosphat (dTTP)

R = H: 2'-Desoxyuridin-5'-triphosphat (dUTP)

Abb.2
Uracil-DNA-Glycosylase mit Uracil

PDB-Code: 2EUG.

1)dUTP: Desoxyuridin-5'-triphosphat
2)dTTP: Desoxythymidin-5'-triphosphat
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