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Die PCR in der Praxis

Die differential-display-PCR

Die differential-display-reverse-Transkriptase-PCR (DDRT-PCR) ist eine von Liang und Pardee 1992 entwickelte Variante der Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR). Auch bei dieser Methode besteht das Template für die PCR aus zellulären mRNAs, die zunächst von dem Enzym reverse Transkriptase in cDNAs (abgeleitet von copy-DNA) umgeschrieben werden. Die in der PCR amplifizierten cDNAs werden dann im Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und verglichen.

Mit dieser Methode kann die Zusammensetzung der mRNAs in verschiedenen Zellen oder zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt werden. Ein Vergleich der Genexpression von z.B. einer normalen Körperzelle mit der einer Tumorzelle ermöglicht Aussagen darüber, welche Gene neu oder nicht mehr abgelesen werden, wenn sich die Zelle verändert. Das wird auch mit dem Begriff differenzielle Genaktivität bezeichnet, die dieser Methode auch den Namen gab.

In der Praxis werden die mRNAs zunächst in cDNAs umgeschrieben. Für diese zahlreichen verschiedenen mRNAs einer Zelle werden dann in der PCR degenerierte Primer verwendet, die mit statistisch ermittelbarer Häufigkeit an bestimmte Bereiche der cDNAs binden. Dabei ist allerdings nicht sichergestellt, dass wirklich alle mRNAs erfasst werden, zudem ist die Reproduzierbarkeit dieser Methode nicht hoch. Oft wird einer der beiden Primer so gewählt, dass er den Poly(A)-Schwanz der eukaryontischen mRNA bindet. Bakterielle mRNA, die keinen Poly(A)-Schwanz besitzt, wird üblicherweise mit zwei Zufallsprimern amplifiziert.

Eine Fortentwicklung der DDRT-PCR ist die EDDRT-PCR (enhanced-differential-display-reverse-Transkriptase-PCR), bei der längere Primer eingesetzt werden, die höhere Annealing-Temperaturen erlauben und so die Reproduzierbarkeit der Methode erhöhen.

Serielle Analyse der Genexpression (SAGE)

Dieses Verfahren von Velculescu et al. (1995) dient ebenfalls zur Analyse des Genexpressionsprofils. Anders als beim differential display wird mit der SAGE die Häufigkeit bestimmt, mit der eine bestimmte mRNA zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Zelle vorhanden ist: von jeder cDNA wird ein kurzer Bereich von 10-15 Basenpaaren (auch tag genannt) als Sonde verwendet, deren Menge sich quantifizieren lässt.

Literatur

Liang, P.; Pardee, A. B. (1992): Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. In: Science. 257 , 967-71
Velculescu, V. E.; Zhang, L.; Vogelstein, B.; Kinzler, K. W. (1995): Serial analysis of gene expression. In: Science. 270 , 484-7
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