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Die PCR in der Praxis

Thermostabile Polymerasen

Abb.1
3D-Modell der Taq-DNA-Polymerase

Als Kary Mullis die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) entwickelte, benutzte er in der Anfangszeit das so genannte Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aus dem Bakterium E. coli. Diese Polymerase verfügt über eine 3'-5'-Korrekturfunktion (Exonuclease-Aktivität, auch proofreading-Aktivität genannt), die bewirkt, dass Synthesefehler während der Polymerisationsreaktion vom Enzym gleich wieder ausgebessert werden.

Das Enzym aus Darmbakterien ist allerdings hitzeempfindlich und wird bei jedem Erhitzungsschritt deaktiviert. Vor einer neuen Verlängerungsphase musste jedes Mal erneut Polymerase zugegeben werden - eine extrem umständliche Prozedur, die eine Automatisierung der PCR damals noch unmöglich machte.

Der Siegeszug der PCR wurde erst durch den Hinweis eines Kollegen von Mullis auf temperaturstabile Polymerasen möglich. H. Ehrlich ist zwar nicht so berühmt geworden wie der Nobelpreisträger Mullis, dafür aber durch das entsprechende Patent um ein Vielfaches reicher. Die erste hitzestabile Polymerase stammt aus dem thermophilen Archebakterium Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) und hat keine Korrekturfunktion. Werden die PCR-Fragmente später für Klonierungsreaktionen eingesetzt, führen die Fehler während der DNA-Synthese meist zu unerwünschten Ergebnissen.

Heute gibt es zahlreiche, für diverse Anwendungen optimierte DNA-Polymerasen aus thermophilen Bakterien. Allen gemeinsam ist ein Temperaturoptimum zwischen 70 und 80 °C.

Tab.1
Thermostabile Polymerasen und ihre Eigenschaften
NameOrganismusEigenschaften
TaqThermus aquaticuskeine 3'-5'-Exonuclease (keine Korrekturfunktion)
PfuPyrococcus furiosus3'-5'-Exonuclease, geringste Fehlerrate aller bekannten thermophilen Polymerasen
PwoPyrococcus woesei3'-5'-Exonuclease
Vent (Tli)Thermococcus litoralis3'-5'-Exonuclease, hohe Temperaturstabilität
TgoThermococcus gorgonarius3'-5'-Exonuclease mit sehr geringer Fehlerrate

Kommerziell sind zahlreiche gentechnisch veränderte Varianten oder Mischungen dieser Ursprungsenzyme erhältlich - Enzyme, die nicht bei einer bestimmten Temperatur aktiv sind (hot-start- oder fast-start-Polymerasen), Enzyme mit besonders geringer Fehlerrate (high-fidelity-Polymerasen), besonders schnelle (high-speed-)Polymerasen oder Enzyme, die besonders lange Transkripte kopieren können (long-range- oder expand-Polymerasen).

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