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Einführung in die PCR

Thermostabile DNA-Polymerasen und ihre Verwendung in der PCR

Als Mullis die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) entwickelte, benutzte er nur einen Teil des damals üblicherweise verwendeten Enzyms aus dem Darmbakterium E. coli. Das so genannte Klenow-Fragment, benannt nach dem dänischen Biochemiker Hans Klenow, entsteht aus einer enzymatischen Spaltung dieser DNA-Polymerase.

Das Klenow-Fragment umfasst den Hauptteil des Gesamtenzyms und beinhaltet neben der Polymerase-Aktivität noch immer die 3'-5'-Exonuclease-Korrekturfunktion, so dass Kopierfehler bei der PCR ausgebessert werden können (proofreading-Aktivität). Das Enzym kontrolliert also den letzten Einbauschritt und kann, falls das Ergebnis nicht passt, das letzte Nucleotid auch wieder herausschneiden und entsprechend ersetzen. Dem Klenow-Fragment fehlt aber die 5'-3'-Exonuclease-Aktivität, die einen möglicherweise noch bestehenden alten DNA-Strang in Syntheserichtung abbauen könnte - eine Funktion, die bei der PCR auch nicht benötigt wird.

Wie die normale vollständige E.-coli-Polymerase ist auch das Klenow-Fragment hitzeempfindlich und wird bei dem Erhitzungsschritt inaktiviert. Vor einer neuen Verlängerungsphase musste also jedes Mal erneut Polymerase zugegeben werden - eine extrem umständliche Prozedur.

Abb.1
Modell der Taq-DNA-Polymerase

Ein Kollege von Mullis, H. Ehrlich, gab diesem damals den Tipp, es doch mit temperaturstabilen Enzymen zu probieren. Die Taq-Polymerase, die erste hitzestabile Polymerase, stammt aus dem thermophilen Archebakterium Thermus aquaticus, das in heißen Quellen lebt. Bei dem Denaturierungsschritt der PCR bleibt dieses Enzym aktiv.

Mittlerweile werden für die PCR fast ausschließlich hitzestabile Enzyme eingesetzt, die in einem Bereich zwischen 70 und 80 °C optimal arbeiten. Da der Taq-Polymerase die 3'-5'-proofreading-Aktivität fehlt, werden heute Polymerasen mit dieser Korrekturfunktion aus anderen thermophilen Bakterien bevorzugt, beispielsweise die Pfu-Polymerase aus Pyrococcus furiosus.

Übung

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