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Einführung in die PCR

Die Primer

Abb.1
Haarnadelschleife eines Nucleinsäurestranges

Primer sind zumeist kurze DNA- oder RNA-Oligonucleotide, die als Startpunkt für die DNA-Synthese durch DNA-Polymerasen dienen.

Für eine Verwendung in der PCR geeignete Primer sollten

  • eine Länge von 18-24 Nucleotiden haben,
  • keine internen Haarnadelschleifen (hairpin loops) oder anderer Sekundärstrukturen bilden,
  • nicht an sich selbst (Homodimere) oder an andere Primer (Heterodimere) binden,
  • über eine gleichmäßige Verteilung der Purine und Pyrimidine verfügen und keine Bereiche haben, in denen viele gleiche Nucleotide aufeinander folgen, und
  • annähernd gleiche Schmelztemperaturen (Tm) im Bereich von 55-65 °C aufweisen.

Tipps für die Wahl der Primer

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Abb.2
B-DNA als Modell

Strang B einblenden

Strang B in silber

Strang A und B (Cartoon-Darstellung)

nur Strang A (Ball and Stick; Ausgangsdarstellung)

Die Primer werden so gewählt, dass sie an die komplementären Sequenzen des DNA-Templates binden und der Polymerase ein freies 3'-OH für den Beginn der Polymerisation bieten. Dabei ist es extrem wichtig, dass die letzten drei oder vier Nucleotide exakt passen und besonders stabil sind. Aufgrund der höheren Stabilität sollte der Primer mit zwei oder besser sogar noch drei GC-Basenpaaren enden1). Passt das letzte Nucleotid nicht, wird die PCR keinen Erfolg haben.

Die Schmelztemperatur (Tm) kann für jeden Primer mit Hilfe einer einfachen Formel berechnet werden (siehe Hybridisierungstemperatur). Wenn die Schmelztemperatur der beiden Primer zu unterschiedlich ist, wird mindestens einer der beiden Primer nicht optimal an die DNA binden.

Auch die Primer-Konzentration ist ein wichtiger Faktor: Wird der Primer in zu geringer Konzentration eingesetzt, gibt es nur wenig oder gar kein Reaktionsprodukt, während es bei einer zu hohen Primer-Konzentration zu unspezifischer Primer-Bindung (Fehlpriming) und einer Akkumulation unspezifischer Produkte kommen kann. In der Praxis haben sich Primer-Konzentrationen zwischen 0,1 und 1,0 μmol/L als besonders gut geeignet erwiesen. Primer werden synthetisch hergestellt (siehe auch Oligonucleotid-Synthese) und können auch entsprechend der gewünschten Detektionsmethode markiert sein (siehe nachfolgenden Abschnitt Die Nucleotide).

1)Drei Wasserstoff-Brücken pro Basenpaar sind stabiler als zwei.
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