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Einführung in die PCR

Der Nachweis von PCR-Produkten

Abb.1
Schema einer gelelektrophoretischen Trennung

Typisches PCR-Muster nach einer Auftrennung im Agarose-Gel.

Wie erkennt man nun, ob das gewünschte Produkt in der PCR1) synthetisiert worden ist? Im Laboralltag reicht es in vielen Fällen aus, die Größe der neu synthetisierten DNA zu bestimmen, indem nach 25 bis 30 Zyklen ein Teil des PCR-Ansatzes gelelektrophoretisch aufgetrennt und mit einem Größenstandard ( (Abb. 1) , Spur a) verglichen wird.

Die Primer sind in den meisten Fällen so präzise ausgewählt, dass sie bei einer bestimmten Temperatur nur an einer Stelle auf der Template-DNA binden können und nur das gewünschte Produkt entsteht ( (Abb. 1) , Spur b und d). Weichen die Primer nur in einem Nucleotid von der optimalen Sequenz ab, entsteht kein PCR-Produkt mehr und die Spur im Agarose-Gel bleibt leer.

Ist die Temperatur während der Bindung des Primers an die einzelsträngige DNA nicht optimal hoch, kann der Primer u.U. auch an anderen Stellen auf der DNA binden - das Ergebnis sind eine oder mehrere Banden mit falscher Größe ( (Abb. 1) , Spur c und e).

In der medizinischen Diagnostik beispielsweise reicht deshalb eine Schätzung der korrekten Größe des PCR-Produktes auf keinen Fall aus, ebenso wie bei Klonierungen, wenn mit der PCR z.B. nur eine Base ausgetauscht werden sollte (Mutation). In diesen Fällen muss das PCR-Produkt nach der Synthese in der Regel sequenziert werden.

Andere Methoden zum Nachweis von PCR-Produkten: Restriktionsanalyse und Hybridisierung

Neben einer DNA-Sequenzanalyse kann das gewünschte PCR-Produkt auch durch eine Restriktionsanalyse bestimmt werden. Restriktionsendonucleasen sind Enzyme, die ganz bestimmte Basenabfolgen auf der DNA erkennen und an dieser Stelle die DNA zerschneiden. Das dabei entstehende DNA-Fragmentmuster im Agarose-Gel ist bei einer entsprechenden Wahl dieser Enzyme charakteristisch für jeden Menschen.

Abb.2
Schmelzpunktbestimmung

Dieser so genannte Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus (restriction fragment length polymorphism oder RFLP, auch PLP für PCR-Längen-Polymorphismus) wird vor allem bei der Vaterschafts- oder Verwandtschaftsanalyse eingesetzt, bei der die Anzahl der Wiederholungen von bestimmten Sequenzen im Genom bestimmt und zwischen den fraglichen Personen verglichen werden.

Die Hybridisierung zur (ersten) Kontrolle einer erfolgreichen PCR findet aus praktischen Gründen vor allem bei der real-time PCR Anwendung. Bei dieser PCR-Methode wird schon während jedes Amplifikationszyklus anhand von Licht aussendenden Sonden eine Schmelzkurve der Produkte aufgenommen. Der Schmelzpunkt (d.h. mathematisch gesehen der Wendepunkt der Schmelzkurve) unterscheidet sich zwischen verschiedenen DNAs so erheblich, dass mit dieser Methode auch mehrere in einem Ansatz parallel produzierte PCR-Produkte gleichzeitig erfasst werden können, z.B. bei so genannten Multiplex-Analysen.

1)PCR: polymerase chain reaction
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