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Einführung in die PCR

Zusammenfassung

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein modernes molekularbiologisches Verfahren, um genetisches Material zu vervielfältigen. Die Methode ist mittlerweile so automatisiert, dass sich selbst eine geringe DNA-Menge innerhalb relativ kurzer Zeit exponentiell vermehren lässt. Eingesetzt wird das Verfahren nicht nur zur Identifizierung von Krankheitserregern, sondern z.B. auch in der Forensik, in der Paläontologie, bei Vaterschaftstest und zum Nachweis gentechnisch veränderter Materialien.

Die PCR basiert auf dem Prinzip des Kopierens von DNA-Strängen mit Hilfe von Enzymen aus der Klasse der DNA-Polymerasen. Die beiden Stränge der DNA, das DNA-Template, werden durch Erhitzen voneinander getrennt (Aufschmelzen, Denaturierung). Anschließend binden zwei separat synthetisierte, kurze DNA-Abschnitte, die Primer, an ausgewählte Stellen der beiden Einzelstränge (Primer-Annealing). Die angelagerten, komplementären Primer sind der Startpunkt für die Polymerase, um den Doppelstrang wieder zu vervollständigen. Das Enzym fügt dazu Nucleotid um Nucleotid passend zum Elternstrang aneinander (Primer-Extension). Anschließend wird der Prozess aus Denaturierung, Primer-Annealing und Primer-Extension wiederholt. Auf diese Weise entstehen 2, 4, 8, 16, 32, 64 ... 2n Kopien der ursprünglichen DNA.

Diverse Verunreinigungen und Inhibitoren können das Ergebnis einer PCR verfälschen oder die enzymatische Reaktion sogar ganz verhindern. Der Einsatz chromatographisch gereinigter DNA-Templates ist daher von großer Bedeutung. Auch die Konzentration an Magnesium-Ionen und verschiedene Zusätze (Additive) beeinflussen Ausbeute und Spezifität der PCR und müssen im Einzelfall ebenso wie das Temperaturprofil der PCR experimentell angepasst werden. Der Einsatz von thermostabilen Polymerasen verhindert heute, dass die Polymerasen bei jedem Aufschmelzen der DNA deaktiviert werden und neu zugegeben werden müssen.

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