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Einführung in die PCR

Magnesium

Magnesium-Ionen erfüllen bei der PCR drei Aufgaben:

  • sie sind wichtiger Cofaktor der DNA-Polymerase,
  • bilden lösliche Komplexe mit den dNTPs und
  • wirken sowohl auf die spezifische als auch die unspezifische Anlagerung des Primers an die Template-DNA stabilisierend.
Abb.1
Produktbildung in Abhängigkeit von der Magnesium-Konzentration
Magnesium-Konzentration (Mg-Konz.) verschiedener PCR-Ansätze
Spur A B C D E F
Mg-Konz. in mmol/L 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

Die meisten DNA-Polymerasen erfordern die Anwesenheit von zweiwertigen Ionen für ihre Enzymaktivität, in der Regel Magnesium-Ionen. Magnesium-Komplexe der Nucleotide (dNTPs) sind das Substrat, das von der Polymerase in die DNA eingebaut wird. Der Zusatz von Magnesium zur PCR beeinflusst dementsprechend die Enzymaktivität, erhöht aber auch den Schmelzpunkt der doppelsträngigen DNA. Da Magnesium auch von der Template-DNA, den Primern, EDTA1) und den aus der Polymerisationsreaktion stammenden Pyrophosphaten gebunden wird, ist die optimale Konzentration im Vorfeld u.U. schwer zu bestimmen. Üblich sind Konzentrationen von 1,5 mmol/L (mit 200 μmol/L dNTPs) - oder zumindest ein Bereich von 1-10 mmol/L.

Einige thermostabile DNA-Polymerasen wie die Tth-DNA-Polymerase (aus Thermus thermophilus) arbeiten zwar in Gegenwart von Magnesium, zeigen aber in Anwesenheit des ebenfalls zweiwertigen Mangans ein etwas anderes Spektrum ihrer Enzymaktivitäten - in diesem Fall die Aktivität einer reversen Transkriptase, mit der RNA in DNA umgeschrieben werden kann.

In der Praxis ist es mitunter erforderlich, die Konzentration an Magnesium-Ionen zu optimieren. Das gilt besonders dann, wenn trotz sorgfältiger Wahl der Primer, bei gleicher Temperatur etc. kein PCR-Produkt entsteht. Eine zu geringe Magnesium-Konzentration führt zu weniger spezifischen Produkten. Im Gel ist dieser Effekt anhand des Auftretens eines Schmierbande oder zahlreicher dünner Banden erkennbar. Das gilt in ähnlicher Form auch für zu hohe Magnesium-Konzentrationen, die vor allem den Schmelzpunkt der DNA verändern.

Die Fotografie des Gels (Abb. 1) demonstriert den Einfluss des Magnesiums an einem Beispiel aus der Praxis. In den Spuren A und B ist kein spezifisches Produkt zu erkennen, auch in Spur C treten besonders im unteren Teil des Gels noch viele unspezifische Produktbanden auf. Die Menge an spezifischem PCR-Produkt steigt von Spur C nach Spur F hin an.

Beispiele für die Komplexierung von Magnesium durch Nucleinsäuretriphosphate

Übung

1)EDTA: Ethylendiamin-tetraacetat
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