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Einführung in die PCR

Optimierung des Annealing-Schrittes

Der Begriff "Annealing" bezeichnet die Anlagerung des Primers an das Template. Nach dem Schmelzen der DNA wird das Reaktionsgemisch auf eine definierte Temperatur abgekühlt. Bei dieser so genannten Annealing-Temperatur kommt es zur spezifischen Bindung des Primers an sein nun einzelsträngiges DNA-Template, aber auch zu unerwünschten Reaktionen wie dem erneuten Binden der beiden komplementären DNA-Stränge aneinander (Renaturierung) oder zu unspezifischen Bindungen von DNA oder Primern.

Die vorzeitige Renaturierung der DNA wird durch den hohen Primer-Überschuss verhindert, der unter diesen Bedingungen zuerst an die DNA bindet. Eine unspezifische Anlagerung des Primers wird minimiert, indem die Annealing-Temperatur nur wenig (ca. 2 °C) unterhalb des Schmelzpunktes der Primer liegt. Bei optimaler Sequenzübereinstimmung binden die Primer gerade noch stabil an die DNA, während es bei weniger genau passenden Primern keine stabile Primer-Bindung gibt.

Aus der Basenabfolge eines Primers lassen sich der Schmelzpunkt und die Annealing-Temperatur berechnen bzw. mit der Wallace-Regel abschätzen. Dazu wird die Anzahl der Adenosine (A) und Thymidine (T) bzw. der Guanosine (G) und Cytidine (C) bestimmt. Die Anzahl von (A+T) wird mit 2, die von (G+C) mit 4 multipliziert. Die Addition ergibt die Schmelztemperatur in °C:

Schmelztemperatur in °C   =   (A + T) · 2   +   (G + C) · 4

Üblicherweise verwendete Primer haben eine Länge von 18-20 Nucleotiden und eine Schmelztemperatur zwischen 55 und 65 °C. Beide Primer sollten ähnliche Schmelztemperaturen haben, da andernfalls bei der niedrigeren Temperatur gearbeitet muss und der andere Primer dann bereits u.U. unspezifisch bindet.

Der Annealing-Schritt kann zeitlich verlängert werden, um die Effizienz der Primer-Bindung an die DNA zu steigern.

Übung

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