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Praktikum 5: Inverse PCR - Deletion von Genabschnitten

Einführen einer Deletion durch PCR

In diesem Versuch wird das Prinzip der inversen PCR angewendet, die eine Deletion des Bereiches zwischen den beiden 5'-Enden der Primer erzeugt. Ziel ist es, aus dem Standard-Plasmid pUC19 den lacO-Bereich1) zu entfernen. Inverse PCR bedeutet in diesem Zusammenhang, dass nicht wie üblich ein kleiner Bereich eines Plasmids amplifiziert wird, sondern das ganze Plasmid mit Ausnahme eines bestimmten Bereiches, der zwischen den 5'-Enden der beiden Primer liegt. Nach der PCR werden die Enden der Amplifikate zum Doppelstrang aufgefüllt und die gepaarten Enden miteinander verbunden (blunt-end-Ligation mit der T4-Ligase). Das lac-Operon im ausgesparten Bereich der Ausgangs-DNA ist im PCR-Ligationsprodukt nicht mehr vorhanden - die Deletion ist erreicht.

Abb.1

Inverse PCR mit dem Plasmid pUC19. Amp: Ampicillin-Resistenzgen (β-Lactamase), rep: Replikationsursprung, lacZ: β-Galactosidase-Gen, EcoRI: Typ-II-Endonuclease aus E. coli, MCS: multiple cloning site. Die hellblauen Pfeile geben Lokalisation und Orientierung der für die PCR verwendeten Primer an, zwischen denen der Deletionsbereich von 55 Basenpaaren liegt.

Als Ausgangsmaterial für diesen Versuch dient das Plasmid pUC19 (2.686 Bp2)), die beiden Primer pUC19-1 [5'-CCACACAACATACGAGCCGG] und pUC19-2 [5'-GCCAAGCTTGCATGCCTGCA] und die thermostabile TflI-Polymerase. Die TflI-Polymerase stammt aus dem thermophilen Bakterium Thermus flavus und hat eine besonders hohe Prozessivität, d.h. mit dieser Polymerase gelingen besonders lange Transkripte.

Als Produkt der inversen PCR ergibt sich ein um 55 Bp verkürzter, linearisierter pUC19-Vektor (2.631 Bp).

Abb.2
Durchführung einer PCR
1)Operator-Bereich für das lac-Operon
2)Bp: Basenpaare
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