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Praktikum 5: Inverse PCR - Deletion von Genabschnitten

Das DNA-Template

Ein DNA-Template ist die Vorlage, die durch die PCR vervielfältigt (amplifiziert) werden soll.

Abb.1

Die beiden Stränge der DNA trennen sich bei hohen Temperaturen.

Das Template (engl. template "Matrize", "Muster") ist in den meisten Fällen eine einzelsträngige oder doppelsträngige DNA. Auch RNA-Moleküle lassen sich als Template für eine PCR einsetzen, diese müssen aber zunächst durch eine reverse Transkription in DNA umgewandelt werden. DNA-Polymerasen erkennen nur DNA als Substrat.

Bei forensischen Untersuchungen werden oft auch ganze Zellen direkt zur PCR verwendet, beispielsweise aus Blut- und Spermaspuren oder von Haarwurzeln. Hier muss der gewählte Primer optimal zur gewünschten DNA passen, um in der PCR, die unter diesen Bedingungen sehr viele verschiedene zelluläre DNA-Moleküle enthält, möglichst wenige unspezifische Nebenprodukte zu erhalten.

Grundsätzlich reicht ein einziges Molekül an Template-DNA für eine PCR aus (siehe auch Anwendungen in der Paläontologie). Die Ausbeute einer PCR ist allerdings stark von der Qualität dieses DNA-Moleküls abhängig. Bei DNA-Proben aus fossilen Knochen oder von stark verwesten Leichen ist die DNA oft durch den Alterungsprozess oder die Lagerbedingungen beschädigt. In diesem Fall muss das Template mehr oder weniger rein im Versuchsansatz vorliegen. Grundsätzlich ist bei jeder PCR unbedingt darauf zu achten, dass keine Verunreinigungen, z.B. durch vorherige PCR-Ansätze (carry-over-Effekt), durch Hautzellen des Laborpersonals oder die verwendeten Materialien, in den PCR-Ansatz gelangen. In einem prominenten Mordfall führte dies zu sehr überraschenden Ergebnissen (Bericht auf Stern.de, 26.03.2009).

Parameter für ein optimales Template

Eine Reihe von Parametern beeinflusst die Qualität einer DNA für die PCR:

  • Kontamination mit Chemikalien aus dem DNA-Isolierungsprozess Die Polymerase ist ein empfindliches Enzym. Schon Spuren von Chemikalien wie Phenol, Chelatbildnern wie EDTA1), Chloroform, Detergenzien (SDS2), Sarkosyl) oder Ethanol können eine PCR hemmen. Diese Chemikalien werden bei der DNA-Isolierung verwendet und müssen vor der PCR aus der DNA vollständig entfernt werden.
  • Eingesetzte DNA-MengenWerden weniger als 10 ng genomische DNA in der PCR eingesetzt, sollte die Anzahl der Zyklen erhöht und eine hot-start-PCR durchgeführt werden, um Ausbeute und Spezifität der Reaktion zu steigern.Optimale Mengen sind 1-10 ng für bakterielle DNA, 0,1-1 ng für Plasmid-DNA und maximal 200 ng genomische DNA.
1)EDTA: Ethylendiamin-tetraessigsäure
2)SDS: Natrium-dodecylsulfat
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