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Praktikum 5: Inverse PCR - Deletion von Genabschnitten

Die DNA-Polymerase

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Abb.1
DNA-Polymerase mit DNA-Substrat

Die drei DNA-Einzelstränge sind blau, hellblau und violett gefärbt, die beiden Magnesium-Ionen im aktiven Zentrum hellgrün; PDB-Code: 2FMS.

Darstellung des Proteins als durchsichtiges Kalottenmodell (Magnesium silber)

Ursprüngliche Darstellung

Die Polymerase-Kettenreaktion basiert auf einer durch die DNA-Polymerase I katalysierten Reaktion. DNA-Polymerasen sind wichtige Enzyme im zellulären Geschehen, die für die DNA-Verdopplung und die Reparatur des DNA-Strangs verantwortlich sind.

Polymerasen synthetisieren anhand einer einzelsträngigen DNA-Vorlage den Gegenstrang, bis wieder ein doppelsträngiges DNA-Molekül entstanden ist. So sorgen diese Enzyme nicht nur für die identische Verdopplung, sondern schließen auch Lücken in der DNA, die z.B. durch UV-Strahlung oder Chemikalien entstanden sind. Das Substrat für die DNA-Polymerasen sind Nucleotidtriphosphate, bei der Kondensationsreaktion wird Pyrophosphat (Diphosphat) frei. DNA-Polymerasen benötigen in den meisten Fällen Magnesium-Ionen als Cofaktor.

In der Zelle existieren verschiedene DNA-Polymerasen mit unterschiedlichen Eigenschaften. Die eigentliche Aufgabe der DNA-Polymerase I in der Zelle ist die Reparatur von Kopierfehlern oder Schäden in der DNA. Dieses Enzym kann keinen neuen DNA-Strang beginnen, sondern benötigt neben einem intakten Elternstrang ein freies 3'-OH der Lücke im Gegenstrang. Bei der PCR übernimmt der Primer mit seinem freien 3'-OH-Ende die Funktion des Gegenstrangs. Die Synthese verläuft also immer nur in einer Richtung, der 5'-3'-Richtung.

Viele DNA-Polymerasen besitzen neben der Polymerase-Enzymaktivität eine Korrekturfunktion (proofreading-Aktivität), d.h. sie erkennen, ob sie ein falsches Nucleotid in der DNA eingebaut haben, und können dieses gleich wieder herausschneiden (3'-5'-Exonuclease-Aktivität). Manche Polymerasen haben zudem noch eine 5'-3'-Exonuclease-Aktivität, mit der sie einen alten, bestehenden DNA-Strang in Syntheserichtung abbauen können.

Abb.2
DNA-Syntheseschema

In der Zelle wird vor einem falsch eingebauten Nukleotid der DNA-Strang enzymatisch geöffnet (d.h. ein Einzelstrangbruch wird erzeugt). Der beschädigte DNA-Strang wird ein Stück weit vom komplementären Strang verdrängt und die so entstehende größere Lücke durch die DNA-Polymerase I wieder aufgefüllt.

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