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Praktikum 5: Inverse PCR - Deletion von Genabschnitten

Einfügen von Deletionen in der Praxis: Produktreinigung und Ligation

Im ersten Schritt dieses Versuches wurde die PCR durchgeführt. Das Produkt dieser Reaktion wird nun gelelektrophoretisch (präparativ) gereinigt, um dann für weitere Versuche zur Verfügung zu stehen.

Gelelektrophoretische Analyse und Aufreinigung des PCR-Produkts

Herstellung linearisierter pUC19-Plasmid-DNA zur Kontrolle

Für die Größenbestimmung des PCR-Produkts dient der normale Größenstandard und das linearisierte pUC19-Plasmid. Um dieses herzustellen, wird parallel zum PCR-Lauf folgende Spaltungsreaktion durchgeführt:

Tab.1
Ansatz für die Spaltungsreaktion
MengeZusatz
5 µL pUC19-Plasmid-DNA
2 µL 10 x NE-Puffer
1 µL EcoRI-Restriktionsenzym
12 µLbidest. H2O
= 20 µL Gesamtansatz 1 h bei 37 °C inkubieren

10 % des PCR-Ansatzes werden mit einem Größenmarker und linearisierter pUC19-Plasmid-DNA auf ein 1%iges Agarose-Gel gegeben (Details siehe Gelelektrophorese). Das Auftreten einer Bande bei 2.631 Basenpaare signalisiert eine erfolgreiche PCR-Amplifikation. Diese Bande wird anschließend über ein präparatives Agarose-Gel mit dem "QIAquick Gel Extraction Kit" (siehe Fragmentisolierung) extrahiert. Als Resultat werden 30 µL gereinigte Fragment-DNA-Lösung erhalten.

Kinase-Behandlung des PCR-Produkts

Das nach diesem Protokoll hergestellte PCR-Produkt wird von Primern flankiert, denen der Phosphat-Rest am 5'-Ende fehlt. Da dieses DNA-Fragment kein gutes Substrat für die Ligase darstellt, werden die Fragmentenden jetzt mit Kinase und ATP behandelt (siehe auch Kinasierung).

Tab.2
Ansatz für die Kinase-Behandlung
MengeAnsatz
30 µL PCR-Produkt
10 µL 10 x Puffer
1,5 µL T4-Polynucleotid-Kinase
56,5 µL bidest. H2O
2 µL 1 mM ATP
= 100 µL Gesamtansatz 1 h bei 37 °C inkubieren.

Die Kontrolle der Kinase-Reaktion erfolgt im 1%igen Agarose-Gel (Minigel). Wenn 5 % des Ansatzes aufgetragen werden, dürfen keine Abbaubanden zu erkennen sein.

Die verbleibenden 95 µL werden für eine Ligase-Reaktion verwendet.

Verwendung des PCR-Produkts in einer Ligation

Der Ligase-Ansatz setzt sich wie folgt zusammen:

Tab.3
Zusammensetzung des Ligase-Ansatzes
MengeAnsatz
7,5 µLPCR-DNA
4 µL Ligase-Puffer
7,5 µL bidest. H2O
1 µLT4-Ligase
= 20 µL Gesamtansatz über Nacht bei 16 °C inkubieren

Die Transformation von E. coli mit dem Ligationsansatz und die Isolierung der entstandenen Plasmide erfolgt wie in den Versuchen Ligation und Transformation und DNA-Isolierung beschrieben.

Die Plasmid-Charakterisierung erfolgt durch eine Linearisierung mit EcoRI (erwartete Größe: 2.686 - 55 = 2.631 Basenpaare). Außerdem wird das Produkt mit PvuII gespalten. Während im unbehandelten Ausgangsprodukt eine Bande mit 346 Basenpaaren auftritt, wird im gewünschten Produkt eine Bande von 291 Basenpaaren erwartet.

Chemikalienliste

1)dNTPs: Desoxynucleosid-triphosphate
2)TBE: TRIS-Borat-EDTA
3)TE: TRIS-EDTA
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