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Praktikum 5: Inverse PCR - Deletion von Genabschnitten

Einführen von Mutationen in eine DNA

In der Molekularbiologie spielt das Einbringen von Mutationen über die so genannte site-directed mutagenesis, also eine gezielte Veränderung der Basenfolge einer DNA, eine wichtige Rolle. Mit diesem Verfahren lassen sich:

  • Schnittstellen für Restriktionsenzyme einfügen, mit denen ein bestimmtes DNA-Fragment später in einen entsprechenden Vektor zur Vermehrung in der Zelle eingefügt wird,
  • Proteine mit einer Sequenz aus Histidin-Resten am N-Terminus versehen, mit denen sie sich später über Affinitätschromatographie isolieren lassen (Fusionsproteine), oder
  • ganz allgemein Mutationen einführen, um das resultierende Protein in gewünschter Weise zu verändern.

Eine Deletion in ein Stück DNA einzubringen, d.h. in der Praxis ein mehr oder weniger großes Stück aus dieser DNA zu entfernen, war früher ein kompliziertes Verfahren. Die DNA wurde an entsprechender Stelle mit Restriktionsenzymen geschnitten - sofern entsprechende Schnittstellen überhaupt vorhanden waren - und der nun überhängende, einzelsträngige Bereich enzymatisch mit Einzelstrang-spezifischen Nucleasen abgebaut. Für größere Deletionen wurden die resultierenden Fragmente zunächst mit Doppelstrang-spezifischen Exonucleasen wie der Exonuclease III (Exo III) aus E. coli behandelt. Dieses Verfahren zeigte jedoch schwer vorherzusagende Ergebnisse, denn je nach Reaktionsbedingungen und Aktivität des Enzyms wurde mehr oder weniger vom DNA-Strang abgebaut.

Mit der Entwicklung der PCR lassen sich heute Deletionen gezielt in praktisch jedes DNA-Fragment einbringen, ohne dass bestimmte Restriktionsschnittstellen notwendig sind. Das Verfahren wird auf den folgenden Seite erläutert.

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