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Praktikum 5: Inverse PCR - Deletion von Genabschnitten

DNA-Sequenzanalyse mit PCR

Eine PCR1) kann auch zur Sequenzierung nach der Frederick-Sanger-Methode eingesetzt werden.

Die Taq-Polymerase besitzt keine 3'-5'-Exonuclease-Korrekturfunktion und akzeptiert daher auch Didesoxynucleotide (ddNTPs) als Substrat, in diesem Fall Fluoreszenz-markierte ddNTPs. Der Einbau eines Didesoxynucleotids führt zum Abbruch der Polymerisationsreaktion, da an dieses veränderte Nucleotid kein weiteres Nucleotid mehr angehängt werden kann.

Didesoxynucleotide werden folglich hier, wie bei herkömmlichen Sequenzierungsreaktionen auch, als Kettenabbruch-Reagenzien eingesetzt. Das entstehende Gemisch von DNA-Fragmenten mit unterschiedlicher Länge kann wie eine normale Sanger-Sequenzierung elektrophoretisch aufgetrennt und analysiert werden.

In der Praxis wird im ersten Schritt die gewünschte DNA mit nicht-markierten Primern amplifiziert, um genügend DNA-Moleküle für die Sequenzierung herzustellen. Dieser erste PCR-Ansatz wird über eine kleine Chromatographie-Säule gereinigt, um die Primer aus der ersten PCR zu entfernen, da diese bei der eigentlichen Sequenzierungsreaktion stören könnten. Der Reinigungsschritt kann in der Praxis u.U. übersprungen werden, wenn im Reaktionsansatz der ersten PCR die Primer-Konzentration eher gering war und der PCR-Ansatz für die zweite (Sequenzierungs-)PCR stark verdünnt wird. In einem zweiten Schritt wird dann die eigentliche Sequenzierungs-PCR durchgeführt.

Die Einzelstrang-Sequenzierung

An die reine Vervielfältigung des doppelsträngigen DNA-Templates schließt sich eine Einzelstrang-Sequenzierung an, d.h. im Ansatz befindet sich zwar die doppelsträngige DNA, aber durch die Wahl der Primer wird nur einer der beiden Stränge "sichtbar" bzw. nur einer der Stränge kann später isoliert werden.

Bei einer Einzelstrang-Sequenzierung wird für die PCR ein biotinylierter Primer verwendet, während der zweite Primer nicht biotinyliert ist - es entstehen also ein Biotin-markierter und ein nicht-Biotin-markierter DNA-Strang. Nach der Amplifikation über eine PCR (unter Verwendung von Kettenabbruch-Didesoxynucleotiden) werden die biotinylierten Produkte spezifisch durch ihre Bindung an Streptavidin-beschichtete magnetische Kügelchen (beads) isoliert, im automatischen Sequenziergerät mittels Kapillar-Gelelektrophorese anhand ihrer Größe aufgetrennt und analysiert.

Abb.1
Biotin-dUTP

Biotin-16-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat (Biotin-ε-aminocaproyl-γ-aminobutyryl-[5-(3-aminoprop-1-enyl)-2',3'-didesoxyuridin-5'-triphosphat, C32H52N7O18P3S)

1)PCR: polymerase chain reaction
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