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Praktikum 5: Inverse PCR - Deletion von Genabschnitten

Die cDNA

Im normalen Zellgeschehen wird eine DNA über die Transkription in eine mRNA umgeschrieben, die dann am Ribosom in ein Protein übersetzt wird (Translation). Im Labor kann dieser Weg auch anders ablaufen, wenn ausgehend von einer mRNA eine DNA synthetisiert wird, die dann als cDNA (abgeleitet von copy-DNA) bezeichnet wird. Diese Methode ist aus mehreren Gründen sehr wichtig in der Molekularbiologie:

  • Die PCR1) vervielfältigt nur DNA-Moleküle, da die DNA-Polymerase keine RNAs als Substrate akzeptiert. In der medizinischen Diagnostik müssen folglich die Genome der RNA-Viren mit Hilfe des Enzyms reverse Transkriptase erst in cDNA übersetzt werden, bevor ein Nachweis des Erregers über PCR möglich ist.
  • Zur Klärung der Frage, wie oft ein Gen in einer Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt tatsächlich abgelesen worden ist, wird die Menge der einzelnen mRNAs bestimmt. Das geschieht heute durch das Umschreiben der mRNA in cDNA, die dann in einer real-time-PCR vermehrt und quantifiziert werden kann.
  • Während die bakterielle mRNA mehr oder weniger unverändert bleibt, enthält die mRNA der Eukaryonten zunächst noch Introns, die herausgeschnitten werden. Dieser Vorgang, der als Spleißen bezeichnet wird, führt oft zum Verlust von mehr als 90 % der RNA, bevor die reife mRNA dann in ein Protein übersetzt wird. Eine cDNA der gespleißten mRNA entspricht also der Sequenz des späteren Proteins.

Die cDNA-Bank

Eine cDNA-Bank spiegelt die Gesamtheit der zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle vorhandenen mRNAs wider. Je häufiger ein bestimmtes Gen abgelesen und in mRNA übersetzt wurde, desto häufiger ist diese cDNA auch später in der cDNA-Bank vertreten.

Es gibt allerdings eine methodisch bedingte Einschränkung: vermehrt werden bei dieser Methode meistens nur mRNAs, die einen Poly(A)-Schwanz tragen, also z.B. keine ribosomalen RNAs. In Eukaryonten wird an die mRNA ein so genannter Poly(A)-Schwanz angehängt, bevor die reife mRNA den Zellkern verlässt und translatiert wird. Diese Poly(A)-mRNAs lassen sich leicht isolieren, indem man Affinitätssäulen mit oligo-dT einsetzt, an die Poly(A)-mRNA bindet.

Das macht sich auch die PCR einer vollständigen eukaryontischen Genbank zu Nutze: Die gesamte mRNA wird mit Hilfe eines oligo-dT-Primers in ein relativ stabiles RNA-DNA-Hybrid überführt. Nun wird mit Hilfe des Enzyms terminale Transferase an die freien 3'-Enden der neu synthetisierten DNA und der mRNA (also an den Poly(A)-Schwanz) jeweils ein oligo-dG-Schwanz angehängt. Die mRNA wird nun alkalisch hydrolysiert und die verbleibende einzelsträngige DNA mit Hilfe eines Primers gegen den oligo-dG-Schwanz zur doppelsträngigen DNA vervollständigt. Anschließend kann die normale Amplifikation durch einen zweiten Primer komplementär zum jetzt entstandenen oligo-dA-Schwanz stattfinden.

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Abb.1
Abb.2
1)PCR: polymerase chain reaction
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