zum Directory-modus

Anwendungen der PCR

Vorteile der real-time PCR in der klinischen Diagnostik

Die frühen Verfahren der PCR1) waren für die klinische Diagnostik ungeeignet. Der Nachweis des PCR-Produktes erfolgte über eine Gelelektrophorese, die ein nur wenig verlässliches Ergebnis liefert. Die korrekte Größe des PCR-Produktes lässt sich im Gel zwar abschätzen, ob das Produkt aber die korrekte Sequenz enthält, kann mit dieser Methode nicht bestimmt werden. Nahe verwandte Mikroorganismen lassen sich mit dieser Methode nicht unterscheiden.

Genauere Ergebnisse konnten mit der Hybridisierung erzielt werden, die früher vorwiegend als Festphasen-Hybridisierung durchgeführt wurde (Southern Blot) - eine sehr zeitaufwändige Methode, ebenso wie die Sequenzierung des Endproduktes nach einer PCR. Durch das Öffnen und Schließen bei der Probenentnahme der PCR-Produkte, z.B. für eine Hybridisierung, bestand zudem die Gefahr, eine Kontamination einzubringen, wenn dieses PCR-Produkt noch für weitere PCRs verwendet werden sollte (amplicon carry-over). All dies waren erhebliche Nachteile in der klinischen Diagnostik, bei der in kurzer Zeit und mit großer Genauigkeit viele Proben parallel bearbeitet werden müssen.

Die PCR als Routine-Methode der Diagnostik setzte sich erst durch, als die ersten vollautomatisierten Plattformen für die real-time PCR entwickelt wurden. In diesen geschlossenen Systemen werden die Reaktionsgefäße nicht mehr geöffnet und ein amplicon carry-over ist fast ausgeschlossen. Viele Proben können parallel bearbeitet werden und die Möglichkeit, eine Reaktion in Echtzeit zu verfolgen, gibt Aufschluss über den Verlauf der Produktzunahme und die Art des PCR-Produktes. Mit der real-time PCR lassen sich auch nahe verwandte Arten der Infektionserreger aufgrund der Schmelzpunkte der Produkte sicher unterscheiden. In der Multiplex-PCR können mehrere Proben parallel in einem Reaktionsgefäß bearbeitet werden.

Beispiel

Die Diagnose von Keuchhusten

Keuchhusten ist eine schwere Infektionskrankheit der Atemwege und wird durch das Bakterium Bordetella pertussis verursacht. Eine Infektion wurde früher anhand der Kultivierung des Erregers aus dem Hustenschleim (im Auswurf oder durch einen Abstrich) des Patienten nachgewiesen, allerdings mit erheblichen Problemen. In der Anfangsphase der Infektion, die von chronischem Husten mit gelegentlichen krampfartigen Hustenanfällen gekennzeichnet ist, sind die Keimzahlen noch zu gering, um den Erreger überhaupt isolieren zu können. Zudem wächst Bordetella nur sehr langsam und benötigt 3-12 Tage für eine Anzucht. Eine morphologische Unterscheidung von Bordetella pertussis vom eng verwandten Bordetella parapertussis mit einem milderen Krankheitsverlauf ist schwierig.

Heute wird Bordetella pertussis über eine Amplifikation von spezifischen Insertionselementen in der DNA nachgewiesen (IS481 und IS1001). Dazu wird ein Abstrich aus der Nase entnommen und die PCR durchgeführt.

Mit dem so genannten GenoQuick®-Test lässt sich das Ergebnis der Reaktion beispielsweise auch auf einem Teststreifen sichtbar machen. Der Teststreifen wird nach der PCR in den Ansatz getaucht und zeigt ggf. innerhalb von 10 Minuten eine Bordetella-Infektion an. Das bedeutet, dass mittels PCR im Idealfall bereits drei Stunden nach der Probennahme ein Ergebnis vorliegt.

Weiterführende Informationen

News 13.04.2012: "Pathogene: Diagnostischer Schnelltest to go"

1)PCR: polymerase chain reaction
Seite 6 von 13