zum Directory-modus

Affinitätsreaktionen

Immunoassays (IA)

Immunanalytische Verfahren werden eingesetzt, wenn der Analyt nicht über stoffspezifische Eigenschaften (Extinktionskoeffizient, enzymatische Aktivität,...) direkt nachweisbar ist bzw. wenn der Konzentrationsbereich andere Verfahren ausschließt. Voraussetzung ist eine definierte chemische Struktur des Analyten, da nur dann spezifische Antikörper hergestellt werden können. Im Immunoassay muss die Bindung des Analyten an den Antikörper in eine messbare Größe umgesetzt werden. Dabei sind homogene und heterogene Verfahren zu unterscheiden.

Unterteilung

Die Immunoassays werden anhand der verschiedenen Prinzipien der Detektion unterteilt. Die folgende Abbildung liefert eine Übersicht über die Möglichkeiten der Detektion von markierten Systemen.

Abb.1

Üblich sind Immunoassays mit markierten Komponenten, z. B. der RIA (Radio Immuno Assay) oder der ELISA (Enyzme linked immunosorbent assay). Eine Bestimmung nach diesen Methoden wird im klinischen Bereich einschließlich Qualitätssicherung etc. für 5 Euro oder weniger angeboten. An diesem Anspruch müssen sich alle anderen Verfahren messen lassen.

Tab.1
Detektionsprinzipien bei Immunoassays
heterogenhomogen
ELISA Radio-IA Fluoreszenz-IA Scintillation-Proximity-IA (SPIA) Fluoreszenz-Quenching-IA (FQIA) Fluoreszenz-Polarisation-IA (FPIA) Fluoreszenz-Korrelation-IA (FCIA) Resonanter-Energie-Transfer-IA (RETIA)
Wasch-SchrittWasch-Frei ("mix & measure")

Vielen Tests ist ein heterogenes Schema eigen - d.h. der Test wird mit einer immobilisierten Komponente durchgeführt. Die Abtrennung von gebundenen und nicht gebundenen Substanzen kann durch einfache Waschschritte erfolgen. Der eigentliche Nachweis erfolgt erst am Ende des Tests im Gleichgewicht. So vermittelt ein ELISA die Thermodynamik der Bindungsreaktion. Nur aus einer großen Anzahl von Ansätzen bei verschiedenen Konzentrationen können die Bindungsparameter und die z.B. für Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen wichtigen dynamischen Konstanten ermittelt werden. Andererseits sind diese Tests effektiv für hohe Probendurchsätze und große Probenmengen im Routinebetrieb.

Homogene immunanalytische Verfahren

Die Immunreaktion findet in homogener Phase statt und läuft entsprechend schnell ab. Anschließend ist eine Trennung von gebundenem und freiem Analyt notwendig.

Heterogene immunanalytische Verfahren

Die Immunreaktion findet an einer Festphase statt und zwar nach folgender Vorgehensweise:

  • Proben mit unbekannter Analytkonzentration werden in Kunststoffgefäße gegeben.
  • Aufgrund der unspezifischen Adsorption von Substanzen an die Kunststoffoberfläche wird der Analyt an die Gefäßwand gebunden.
  • Durch Zugabe eines Blindproteins werden unbesetzte Bindungsstellen blockiert.
  • Nach Auswaschen wird ein markierter, für den Analyt spezifischer Antikörper im Überschuss zugegeben. Durch den Blockierungsschritt wird sichergestellt, dass dieser Antikörper nur an das adsorbierte Antigen bindet.
  • Nach Ablauf der Immunreaktion wird erneut gewaschen und anschließend die Menge an gebundenem, markiertem Antikörper bestimmt.

Im Vergleich zum homogenen Test ergeben sich höhere Inkubationszeiten, da Analyt und Antikörper zur Gefäßwand diffundieren müssen. Von Vorteil ist, dass sich alle Transportvorgänge auf das Auswaschen des Gefäßes reduzieren - ein Schritt, der problemlos automatisierbar ist. In der beschriebenen Weise ist dies ein direkter Immunoassay, da direkt die Bindung an das Antigen und nicht die Bindung in Konkurrenz zu einer markierten Substanz gemessen wird.

Bindungshemmtest

Beim Bindungshemmtest wird eine Leitstruktur (Polymer etc.) vorgegeben. Die Reaktion zwischen Antikörper und Antigen findet in der homogenen Phase (Lösung) statt. Überschüssiges Antigen bindet anschließend an die Leitstruktur, so dass die Detektion an der immobiliserten Phase stattfindet. Die Reaktion wird "online" verfolgt, so dass aus diesen Messungen die dynamischen Konstanten zugänglich sind.

Abb.2
Detektionsprinzipien bei Immunoassays
Seite 3 von 20