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Affinitätsreaktionen

Detektion der Gleichgewichtskonzentration

Die Gleichgewichtskonzentration des freien Rezeptors lässt sich durch Detektion der Bindung an einem immobilisierten Liganden bestimmen. Bei hoher Ligandkonzentration auf der Oberfläche erfolgt die Bindung des Liganden massentransport-kontrolliert. Die Bindungsrate ist dann von der Art und der Konzentration des immobilisierten Liganden unabhängig. In diesem Fall ist allerdings die Konzentration des freien Rezeptors an der Oberfläche sehr viel geringer als im Volumen und das Gleichgewicht wird gestört. Bei der Detektion im Durchfluss beschränkt sich diese Störung auf eine Diffusionsgrenzschicht mit konstanter Dicke. Dort entsteht zusätzlicher freier Rezeptor mit einer Geschwindigkeit, die von der Dissoziationsratenkonstante und der Konzentration an Ligand-Rezeptor-Komplex abhängt. Damit ergibt sich ein modifiziertes Bindungsmodell mit einem zusätzlichen Parameter C d , das eine zusätzliche Bindungsrate in Abhängigkeit von der Konzentration des Ligand-Rezeptor-Komplex beschreibt:

c R , bind = c 0 , L [ c 0 , R + c 0 , L + 1 K 2 + ( c 0 , R + c 0 , L + 1 K ) 2 4 c 0 , R c 0 , L ] ( 1 C d )

Die quantitative Beschreibung der zusätzlichen Bindungsrate ist für den allgemeinen Fall sehr komplex, da Transport- und Bindungskinetik in homogener Phase gleichzeitig erfasst werden müssen. Im Fall einer vollständigen Beladung des Rezeptors durch den Liganden in homogener Phase wird die Beschreibung vereinfacht. Aufgrund der hohen Konzentration des immobilisierten Liganden in der Wechselwirkungsschicht an der Oberfläche (bis zu 10 mm) kann man annehmen, dass jedes freie Rezeptormolekül, das innerhalb dieser Wechselwirkungsschicht gebildet wird, dort sofort am immobilisierten Liganden bindet. Die residuale Bindungsrate bei vollständiger Blockierung des Rezeptors in homogener Phase ist dann nur durch die Dissoziationsrate, bezogen auf die Wechselwirkungsschichtdicke l , gegeben.

( d Γ d t ) res = k d c R , 0 l

Diese residuale Bindungsrate sollte also in erster Näherung von der Dicke der Diffusionsgrenzschicht und damit von der Pumprate unabhängig sein. Bei geeigneter Parametrisierung der Wechselwirkungsschichtdicke l kann die Dissoziationsratenkonstante aus dieser residualen Bindungsrate bestimmt werden:

k d = ( d Γ d t ) res c R , 0 l

Residuale Bindungsraten für einige typische Parametrisierungen werden in der oben angegebenen Tabelle gezeigt. Daher lässt sich die residuale Bindungsrate für ein gegebenes Ligand-Rezeptor-System durch geschicktes Variieren der Wechselwirkungsschichtdicke l und der eingesetzten Konzentration anpassen.

Tab.1
Residuale Bindungsraten bei verschiedenen Wechselwirkungsparametern
c R , 0 [ µg/mL ] l [ nm ] k d [ s 1 ] ( d Γ d t ) res [ pg/mm 2 /s ]
110010,1
11000,10,01
11010,01
1010011
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