zum Directory-modus

Tutorial MenueProteintrennungLerneinheit 2 von 2

Gelelektrophorese

Isoelektrische Fokussierung (IEF)

Aminosäuren, Proteine und Peptide sind amphotere Moleküle, die positive und negative Gruppen tragen können. Auf dieser Eigenschaft beruht die isoelektrische Fokussierung. Während bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese Proteine i.a. aufgrund ihrer Mobilität im elektrischen Feld getrennt werden, wird bei der isoelektrischen Fokussierung ein pH-Gradient aufgebaut, an dem sich die Proteine im elektrischen Feld entlang bewegen, bis sie den pH-Wert erreicht haben, der ihrem isoelektrischen Punkt (IEP) entspricht. An diesem Punkt ist die Ladung des Proteins praktisch null und das Protein wandert nicht weiter. Die IEF hat gegenüber anderen Elektrophorese-Verfahren zwei wichtige Vorteile: Einerseits findet kaum Diffusion der Proteine statt (sie werden durch das elektrische Feld an ihrem IEP gehalten), und andererseits entsteht wenig Hitze, da der Stromfluss im Prinzip zum Erliegen kommt, wenn alle Proteine ihren isoelektrischen Punkt erreicht haben.

Die IEF beruht also auf einem ganz anderen Trennprinzip als die SDS-Gelelektrophorese, und beide Methoden werden häufig gemeinsam wie bei der zweidimensionalen (2D) Gelelektrophorese eingesetzt, um eine optimale Auftrennung von Proteinen zu erreichen. Die IEF wird auf schmalen Gelstreifen ausgeführt und liefert eine lineare Verteilung der Proteine. Diese Gelstreifen werden dann für die 2. Dimension der Gelelektrophorese auf ein SDS-Gel gebracht. Bei der IEF können z.B. Isomere getrennt werden, die das gleiche Molekulargewicht, aber eine unterschiedliche Ladung haben. Auch einige Modifikationen wie z.B. Phosphorylierungen, die die Ladung eines Proteins verändern, lassen sich so nachweisen.

Abb.1

Die erste Dimension der 2D-Gelektrophorese, die isoelektrische Fokussierung. Im Beispiel rechts sind acht Röhrchen gezeigt, in denen die Proben aufgrund ihrer Nettoladung getrennt werden.

Bei der IEF werden meistens drei- bis vierprozentige Polyacrylamid-Gele (seltener Agarose-Gele) eingesetzt, die einen pH-Gradienten enthalten. Um diesen pH-Gradienten zu erzeugen, werden dem Puffer sogenannte Trägerampholyte in einer Konzentration von 2-2,5 % (w/v) zugesetzt. Die Ampholyte haben eine geringere molekulare Masse und bilden den gewünschten pH-Gradienten aus, bevor die Proteine ihren pI erreichen. Durch eine geschickte Wahl der Trägerampholyte können bestimmte pH-Bereiche abgedeckt und damit die Trennschärfe verbessert werden (z.B. der pH-Bereich von 3-10 oder der Bereich von 4-5).

Seite 13 von 15