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Gelelektrophorese

Proteinblot auf eine Membran

In den meisten Fällen werden Proteine nach der Gelelektrophorese im Gel direkt durch Färbeverfahren (Coomassie- oder Silberfärbung) visualisiert, um Informationen über z.B. die molekulare Masse der Proteine oder den Reinheitsgrad der Präparation zu erhalten. Werden die Proteine aber aus dem Gel auf eine Membran übertragen (Blot), können eine ganze Reihe anderer Verfahren zur Proteianalyse eingesetzt werden, da die Proteine nun für die Reagenzien zugänglich sind. Diese Blots lassen sich ebenfalls anfärben, mit Lectinen behandeln (um Kohlenhydrat-Reste nachzuweisen) oder für immunologische Untersuchungen einsetzen. Der Transfer des Proteins auf die Membran erfolgt durch das Anlegen einer Spannung (Elektroblot) in Puffertanks als tank-blot-Verfahren oder im halbtrockenen Blotverfahren (semi-dry blot), bei dem der Transfer über lediglich puffergesättigte Filterpapiere erfolgt.

Grundsätzlicher Aufbau eines semi-dry-Proteinblots

Eine Membran (dunkelgrau) wird auf das Proteingel (braun) gelegt und zwischen mehrere Lagen saugfähigen, feuchten Papiers und Schaumstoff (schwarz) deponiert. Die Spannung wird so angelegt, dass die negativ geladenen Proteine vom Gel auf die Membran wandern. Für den Proteintransfer werden Nitrocellulose-Membranen oder die etwas widerstandsfähigeren Membranen aus Polyvinylidendifluorid (PVDF) verwendet. Der Semidry-Blot hat den Vorteil, dass der Transfer gleichmässig über das ganze Gel erfolgt und nur geringe Mengen an Blotpuffer benötigt werden. Beim Zusammenstellen des Blots ist darauf zu achten, dass alle Teile gut mit Blotpuffer getränkt sind und keine Luftblasen auftreten. Der elektrophoretische Transfer erfolgt dann bei 10 V für 30 min.

Abb.1
Aufbau eines Proteinblots

Detektion von Proteinen auf der Membran nach dem Blot

Zur Detektion von Proteinen auf der Membran lassen sich verschiedene Verfahren verwenden, die grundsätzlich entweder auf der spezifischen Bindung eines Antikörpers an das gesuchte Protein (Immunoblot) oder der Anfärbung aller Proteine auf der Membran basieren. Proteine können aber auch in vivo oder in vitro radioaktiv markiert und dann nach dem Transfer durch das Auflegen eines Röntgenfilms visualisiert werden.

1. Spezifische Erkennung des Antigens durch Bindung eines Antikörpers

Proteine oder ganz allgemein antigene Determinanten lassen sich spezifisch nachweisen, indem die Membran mit entsprechenden Antikörpern inkubiert wird, die an diese antigenen Determinanten binden. Die Visualisierung erfolgt i.d.R. über die Bindung eines zweiten Antikörpers, der radioaktiv markiert sein kann oder an ein Enzym gekoppelt ist, das eine bestimmte Farbreaktion katalysiert. Kolorimetrische Verfahren haben vor allem den Vorteil, dass die Entstehung des Farbniederschlags beobachtet und im richtigen Moment gestoppt werden kann, bevor die Membran überfärbt ist. In der Regel ist der Farbkomplex stabil oder bleicht erst nach Monaten aus. Bei den Chemilumineszenz-Verfahren wird ein Enzym-Konjugat verwendet, das Licht emittiert (die Visualisierung erfolgt hier durch das Auflegen eines Films für einige Sekunden bis Minuten). Diese Lichtemission lässt sich allerdings nur für ca. 24 Stunden nachweisen.

Tab.1
Detektionsmethoden
DetektionsprinzipVerfahrenSensitivität
Kolorimetrisch Meerrettich-Peroxidase (Horseradish Peroxidase oder HRP)bis 500 pg Protein
alkalische Phosphatase (AP)bis 100 pg Protein
amplifizierter AP-Assaybis 10 pg Protein
Chemiluminiszenzalkalische Peroxidasebis 10 pg Protein

2. Anfärbung der Proteine auf der Membran

Häufig ist es notwendig, den Proteintransfer vom Gel auf die Membran zu überprüfen oder einen Vergleich des Proteinmusters zu haben, der im Gegensatz zu angefärbten Polyacrylamid-Gelen nicht oder nur wenig beim Trocknungsprozess schrumpft (auch die Amidoschwarz-Färbung führt zu einer leichten Schrumpfung der Membran, da hier mit Methanol gearbeitet wird). In diesen Fällen werden alle Proteine auf der Membran angefärbt. Bei der Biotin-Methode werden alle Proteine biotinyliert, dann ein Enzym-Konjugat an das Biotin gekoppelt und mit entsprechenden Substraten eine Farbreaktion durchgeführt.

Tab.2
Färbemethoden
PrinzipVerfahrenSensitivität
Bindung eines FarbstoffesAmidoschwarzbis 100 ng Protein
-kolloidale Goldfärbungbis 1 ng Protein
-modifizierte kolloidale Goldfärbungbis 10 pg Protein
enzymgekoppelte DetektionBiotinylierung des Proteinsbis 50 ng Protein

Literatur

Towbin, H.; Staehelin, T.; Gordon, J. (1979): Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.. In: Proc.Natl.Acad.Sci.. 76 , 4350-4354

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