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Tutorial MenueProteintrennungLerneinheit 1 von 2

Chromatographie von Proteinen

Reversed-Phase-FPLC

Bei dieser Chromatographie-Methode werden niedermolekulare Komponenten wie kleinere Peptide, Aminosäuren oder auch Nucleinsäuren anhand ihrer hydrophoben Eigenschaften getrennt. Die Reversed-Phase-FPLC ermöglicht eine schnelle Auftrennung und eine gute Auflösung der Einzelkomponenten.

Als stationäre Phase werden verschiedene relativ unpolare Medien verwendet, z.B. Silica-Gele, an die Alkylketten mit einer Kettenlänge bis zu 18 C-Atomen kovalent gebunden sind. Die mobile hydrophile Phase besteht aus einem organischen Lösungsmittel in wässriger Lösung (beispielsweise Methanol und/oder Acetonitril). Je lipophiler eine Substanz in der zu trennenden Probe ist, desto eher wird sie an die lipophile, stationäre Phase binden und auf der Säule zurückgehalten werden. Umgekehrt gilt: je hydrophiler eine Komponente ist, desto schneller wird sie sich in der hydrophilen, mobilen Phase bewegen.

Wie hydrophil die mobile Phase ist, hängt vom Anteil des organischen Lösungsmittels ab. Je mehr organisches Lösungsmittel in der wässrigen Phase enthalten ist, desto besser werden sich auch hydrophobe Komponenten in der mobilen Phase bewegen.

Die Selektivität wird also durch verschiedene Parameter beeinflusst:

  • die Wahl der Stationärphase (also die an das Silica-Gel gekoppelten Reste).
  • Art und prozentualer Anteil des organischen Lösungsmittels in der wässrigen, mobilen Phase.
  • eine Änderung des pH-Wertes verändert auch die Hydrophobizität von Komponenten mit basischen und/oder sauren Gruppen.
  • ionische Komponenten werden hydrophober, wenn ein Agens zugesetzt wird, das diese Ionen bindet.
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