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Chromatographie von Proteinen

Säulenmaterialien für die Ionenaustauschchromatographie

Ionenaustauscher
Ionenaustauscher interagieren im Prinzip über elektrostatische Wechselwirkung mit Proteinen und werden in zwei Klassen eingeteilt: Austauscher mit positiv geladener Matrix (Anionenaustauscher) und Austauscher mit negativ geladener Matrix (Kationenaustauscher). Innerhalb dieser beiden Klassen wird dann nach Stärke der Austauscher (starke oder schwache Anionen- bzw. Kationenaustauscher) und der Chemie der Substituenten unterschieden.

Die Ionenaustauschchromatographie wurde Mitte der 50iger Jahre von H.A. Sober und E.A. Peterson etabliert, die erstmals DEAE- und CM-Cellulose-Derivate synthetisierte. Polystyren-Derivate werden etwa seit dem 2. Weltkrieg verwendet. Als Trägermaterialien eignen sich auch Dextrane, Agarose und synthetische hydrophile Polymere. Die ionisierbaren Gruppen sind an die Hydroxy-Gruppen der Matrix angeheftet. Zu den mit am häufigsten verwendeten Austauschern zählen DEAE (Diethylaminoethyl-Verbindung), eine schwache Base mit positiver Nettoladung, die Anionen bindet, und CM (Carboxymethyl-Verbindung), eine schwache Säure, die entsprechend Kationen binden kann. DEAE-Cellulose ist bei pH-Werten über 9,5 ungeladen und selbst bei pH 6 noch nicht vollständig protoniert. Dieses bedeutet, dass dieses Material bei physiologischen pH-Werten als starker Puffer wirkt.

Polystyren-basierende Ionenaustauscher können auch quarternäre Ammonium-Gruppen als stark basische Anionenaustauscher oder Sulfonsäure-Gruppen als stark saure Kationenaustauscher tragen. In der Hochdruck-Ionenaustauschchromatographie werden kleine Kügelchen (beads) verwendet, die aus Silikat-Derivaten hergestellt sind. Diese Silikate sind mit einer hydrophilen Schicht überzogen, die die geladenen Gruppen trägt. Andere Materialien basieren auf quervernetzten organischen Nicht-Kohlenhydrat-Polymeren, wie z.B. Mono Q und Mono S der Firma Pharmacia. Da die Ladung eines Proteins vom pH-Wert abhängt, muss der Puffer genau gewählt werden. Der Adsorptionspuffer enthält meistens nur etwa 0,01 bis 0,05 molL-1 Salz, wobei der pKa des Salzes um den pH-Wert liegen sollte, bei dem die Chromatographie durchgeführt wird. Für einen Anionenaustauscher ist z.B. ein Tris-Puffer (pKa 8,2) mit Cl- als Gegenion geeignet, für einen Kationenaustauscher z.B. Phosphat-, Carbonat-, Acetat- oder MES (Morpholinoethansulfonat)-Puffer mit K+ oder Na+ als Gegenion.

Tab.1
Funktionelle Gruppen von Ionenaustauschern: Anionenaustauscher
NameAbkürzungpK-Werte
DiethylaminoethylDEAE9,0 bis 9,5
TrimethylhydroxypropylQA-
Quarternäre AminoethylQAE-
Quarternäre AminomethylQ-
TriethylaminomethylTEAE9,5
TriethylaminopropylTEAP-
PolyethyleniminPEI-
Tab.2
Funktionelle Gruppen von Ionenaustauschern: Kationenaustauscher
NameAbkürzungpK-Werte
Metharylat-6,5
CarboxymethylCM3,5-4
OrthophosphatP3 und 6
SulfonatS2
SulfoethylSE2
SulfopropylSP2-2,5

Literatur

Sober, H. A.; Gutter, F. J.; Wycoff, M. M.; Peterson, E. A. (1956): Chromatography of Proteins. II. Fractionation of Serum Protein on Anion-exchange Cellulose. In: J. Am. Chem. Soc.. 78 , 756-763
Sober, H. A.; Peterson,, E. A. (1958): Protein chromatography on ion exchange cellulose.. In: Fed. Proc.. 4 , 1116-1126
Peterson,, E. A.; Sober, H. A. (1958): Chromatography of proteins. I. Cellulose ion- exchange adsorbents. In: J. Amer. Chem. Soc.. 78 , 751-755

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