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Chromatographie von Proteinen

Die HPLC

HPLC
Die HPLC (high performance liquid chromatography, Hochleistungs- oder Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie) ist eine Form der Flüssigkeitschromatographie, mit der die einzelnen Komponenten einer Lösung aufgetrennt werden können. Diese Komponenten verteilen sich unterschiedlich zwischen der mobilen flüssigen und der stationären festen Phase und bewegen sich daher mit unterschiedlicher Geschwindigkeit durch die Säule.

Das Prinzip dieser Methode wurde in den 70er Jahren zur Isolierung kleiner Moleküle entwickelt. Bei der HPLC werden schmale Säulen verwendet, die als Matrix kleine, mit der stationären Phase überzogene Perlen enthalten.

Abb.1
HPLC-Säulen

Die mobile Phase ist i.d.R. ein Gemisch aus zwei oder mehr verschiedenen Lösungsmitteln. Als Trennverfahren selbst kann Adsorption, Ionenaustausch, Gelfiltration oder Verteilung zwischen verschiedenen Phasen verwendet werden. Die mobile Phase wird mit hohem Druck (bis zu 400 bar) durch die Säule gedrückt. Die Probe wird entweder mit einer Spritze injiziert oder über einen sogenannten sample loop (den Probenschlauch) auf die Säule aufgebracht. Die eluierten Substanzen werden dann über Fluoreszenz-Detektoren, UV-Absorption oder über Refraktometer nachgewiesen.

Die HPLC hat eine ganze Reihe von Vorteilen:

  • eine Aufreinigung ist innerhalb kürzester Zeit möglich.
  • sie bietet eine gute Auflösung und eine hohe Empfindlichkeit.
  • sie verläuft automatisiert.

Zur Aufreinigung großer Mengen an Proteinen ist die HPLC allerdings nur wenig geeignet bzw. sehr teuer. Zur (analytischen und präparativen) Aufreinigung von Proteinen entwickelte die Firma Pharmacia (Uppsala, Schweden) die FPLC (fast protein liquid chromatography).

Abb.2
FPLC-Gerät
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