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Tutorial MenueProteintrennungLerneinheit 1 von 2

Chromatographie von Proteinen

Die Protein-Isolierung mit Hilfe eines His-Tag

Für die Isolierung von Proteinen steht ein breites Spektrum an Methoden zur Verfügung, so z.B. die Isolierung über eine gentechnisch hergestellte Fusion des gewünschten Proteins mit einem Hexapeptid der Aminosäure Histidin. Diese Fusion ermöglicht eine Aufreinigung des Fusionsproteins über Affinitätschromatographie.

Bei diesem Verfahren wird die DNA-Sequenz des zu isolierenden Proteins am C- oder N-Terminus um die Codons eines His-Tags (His-Linker, bestehend aus sechs Histidin-Resten) ergänzt.

Dieser His-Tag bindet spezifisch an ein Säulenmaterial mit zweiwertigen Nickel-Ionen. Das Ni2+-Ion ist in einem oktaedrischen Komplex mit dem Trägermaterial und Wasser-Molekülen gebunden. Diese können durch Histidin verdrängt werden, wodurch ein sehr stabiler Chelat-Komplex entsteht. Ni2+ ist auf diesen Säulen durch Nitrilotriessigsäure-Reste gebunden und kann mit zwei Histidin-Resten des Proteins im Austausch gegen Wasser interagieren. Diese Spezifität gewährleistet, dass nur das Fusionsprotein an das Säulenmaterial bindet.

Die Elution des Fusionsproteins erfolgt mit Imidazol, das das Histidin des Proteins kompetitiv aus dem Chelat-Komplex verdrängt. Alternativ kann auch ein Puffer mit niedrigem pH-Wert verwendet werden, der die Protonierung des Imidazol-Rings im Histidin bewirkt. Der enthaltene Stickstoff kann dann nicht mehr als Koordinationspartner fungieren.

Für die Expression des zu isolierenden Proteins mit einem His-Linker stehen spezielle Vektorsysteme mit starken Promotoren (z.T. als Kits erhältlich) zur Verfügung, in die das betreffende Gen kloniert werden kann. Die Klonierung muss allerdings punktgenau erfolgen, damit die Leseraster des Proteins und des His-Linkers ineinander laufen und so eine korrekte Anknüpfung der Histidin-Codons gewährleistet ist.

Eine punktgenaue Einklonierung kann mit Hilfe der PCR erreicht werden, indem z.B. die Nucleotidsequenz des zu isolierenden Proteins mit Hilfe modifizierter Primer um die Sequenz des His-Tags erweitert wird.

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