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Tutorial MenueProteinfaltungLerneinheit 1 von 4

Stabilität von Proteinen

Degradation durch Proteasen

Zellen enthalten Proteasen und andere abbauende Enzyme, die zum großen Teil in Lysosomen oder in der Vakuole der Pflanzenzelle gelagert bzw. in das Periplasma (bei Gram-negativen Bakterien) und das Außenmedium abgegeben werden. Beim Aufschluss des Zellmaterials werden diese proteolytischen Enzyme unweigerlich mit dem gewünschten Protein in Lösung gebracht. Die Inaktivierung von Proteasen ist daher ein wichtiger Punkt jeder Proteinisolierung.

Proteasen können häufig durch einen bestimmen pH-Wert oder Temperatur inaktiviert werden. In einigen Fällen ist dies nicht möglich, da das gewünschte Protein bei diesem pH-Wert oder dieser Temperatur nicht mehr stabil ist. Dann werden chemische Agenzien (die natürlich das gewünschte Protein nicht angreifen dürfen) oder Protease-Inhibitoren, die ganz spezifisch an diese Protease binden, dem Isolierungspuffer zugesetzt. Viele Proteasen benötigen auch zweiwertige Ionen für ihre Aktivität und sind in Gegenwart von Chelatoren wie EDTA1) oder EGTA2) inaktiv. Da es eine ganze Reihe von Proteasen mit sehr unterschiedlichen Eigenschaften gibt, werden in der Praxis meistens mehrere Inhibitoren kombiniert.

Gängige Protease-Inhibitoren

Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)

  • inhibiert Serin-Proteasen (Chymotrypsin, Trypsin, Thrombin) und Thiol-Proteasen wie Papain
  • löslich in Isopropanol bis 10 mg/mL
  • wird verwendet in einer Konzentration von 17-174 mg/mL (= 0,1-1 mmolL-1 )
  • nicht stabil in wässerigen Lösungen

Diisopropyl-Fluorophosphat (DFP)

  • inhibiert Serin-Proteasen
  • leicht flüchtig und für den Menschen giftig (DFP reagiert auch mit der Acetylcholin-Esterase)
  • wird heute durch das etwas weniger giftige PMSF ersetzt

Ethylendiamin-tetraessigsäure (EDTA)

  • inhibiert Metalloproteasen
  • löslich in Wasser bis 0,5 molL-1 (bei pH 8-9)
  • wird verwendet in einer Konzentration von 0,2-0,5 mg/mL (= 0,5-1,5 mmolL-1 )
  • die Stammlösung muss mit NaOH auf pH 8-9 gebracht werden, denn sonst fällt EDTA aus

Pepstatin A

  • N-acyliertes Pentapeptid verschiedener Streptomyces-Pilze
  • inhibiert saure Proteasen (Chymosin, Renin, Pepsin, Cathepsin D)
  • löslich in Methanol bis 1 mg/mL
  • Stammlösung 1 mmolL-1 , wird verwendet in einer Konzentration von 0,7 µg/mL (= 0,001 mmolL-1 )

Leupeptine

  • Gruppe von Oligopeptid-Derivaten aus Streptomyces sp.
  • inhibieren Serin- und Thiol-Proteasen (Papain, Cathepsin B)
  • wasserlöslich bis 10 mg/mL
  • Stammlösung 5 mg/mL, werden verwendet in einer Konzentration von 0,005-0,01 mg/mL (= 0,01-0,02 mmolL-1 )
  • inhibieren Serin-Proteasen (Chymotrypsin, Trypsin, Kallikrein, Plasmin)

Aprotinin

  • basisches Polypeptid aus 58 Aminosäuren
  • wasserlöslich bis 10 mg/mL bei pH 7-8
  • wird verwendet in einer Konzentration von 0,002-0,01 mg/mL (= 0,003-0,015 mmolL-1 )
  • ist nicht stabil < pH 12,8
Abb.1
Pepstatin A
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