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Stabilität von Proteinen

Die Stabilität von Proteinen: praktische Aspekte

Proteine sind stabil, weil die Aminosäuren miteinander und mit dem Lösungsmittel Wasser interagieren. Cystein-Reste im Protein können mit benachbarten Cystein-Resten Disulfid-Brücken bilden (die die Tertiärstruktur eines Proteins erheblich stabilisieren), geladene Aminosäuren können mit entgegengesetzt geladenen Aminosäuren wechselwirken, Wasserstoff-Brücken bilden sich aus und ungeladene Aminosäuren bilden hydrophobe Bereiche, die Wasser-Moleküle weitgehend ausschließen (hydrophober Effekt).

Hinweis
Trotz all dieser Effekte ist der stabil gefaltete Zustand eines Proteins energetisch oft nur geringfügig günstiger als der ungefaltete Zustand (bei dem die Aminosäuren mit den umgebenden Wasser-Molekülen interagieren), und zahlreiche Faktoren müssen berücksichtigt werden, wenn diese Proteine in ihrer nativen Struktur isoliert werden sollen.

Proteine verlieren ihre native Struktur und denaturieren, wenn sie beispielsweise extremen Temperaturen oder extremen pH-Werten ausgesetzt werden (siehe die folgenden Seiten). Aber auch eine ganze Reihe anderer Faktoren, die empirisch für jedes einzelne Protein überprüft werden müssen, können die Stabilität eines Proteins bei der Aufreinigung beeinträchtigen. Während manche Proteine beim Kontakt mit bestimmten Oberflächen (Glas, Kunststoff) ausfallen, reagieren andere sehr empfindlich auf Schaumbildung während der Isolierung, die Anwesenheit von Schwermetall-Ionen, die an das Protein binden, oder die Verdünnung unter eine bestimmte Konzentration in Lösung. Ganz allgemein gilt:

  • Große Proteine sind häufig stabiler als kleine Proteine
  • Proteine mit Disulfid-Brücken entfalten sich weniger leicht und sind daher weniger geneigt, an Oberflächen zu binden.
  • Die Bindung des Proteins an Oberflächen kann durch den Zusatz von Phospholipiden und von oberflächenaktiven Substanzen reduziert werden. Häufig wird bei der Aufreinigung eines Proteins auch Albumin zugesetzt. Albumin ist sehr gut löslich und stabilisiert andere Proteine in wässriger Lösung.
  • Da Proteine auch an der Wasser/Luft-Grenzfläche aggregieren können, sollte bei der Aufreinigung eines Proteins Schaumbildung oder heftiges Schütteln vermieden werden (denn dadurch wird diese Grenzfläche erheblich vergrößert!).

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Abb.1
Adsorption und Aggregation

Die Aufbewahrung von Proteinen

Während einige Proteine über Jahre ohne Aktivitätsverlust bei 70°C oder sogar 20°C gelagert werden können, lassen sich andere Proteine nur kurze Zeit (Tage oder Stunden) lagern, bevor sie irreversibel aus der Lösung ausfallen oder ihre Aktivität verlieren. Generell ist es so, dass die Halbwertszeit eines Proteins in Lösung bei niedriger Temperatur verlängert wird. Wichtig ist da aber das schnelle Einfrieren, damit keine Phasentrennung innerhalb der Protein-Suspension auftreten kann. Eine Phasentrennung kann dazu führen, dass lokal sehr hohe bzw. auch niedrige Pufferkonzentrationen entstehen und der pH-Wert in diesen Bereichen um +/- drei pH-Einheiten schwankt. Möglichkeiten der Aufbewahrung sind z.B.

  • Zusatz von Glycerol. Bei vielen Proteinen führt der Zusatz von Glycerol (bis zu 50 % w/v) zu längerer Haltbarkeit bei tiefen Temperaturen, vor allem, weil Glycerol/Proteingemische auch bei tiefen Temperaturen nicht einfrieren. Glucose, Saccharose, Fructose und Sorbitol scheinen einen ähnlichen Effekt auf die Stabilität eines Proteins in Lösung zu haben
  • Aufbewahrung eines Proteins in Ammoniumsulfat (also als Präzipitat) bei 4°C
  • Fällung eines Proteins mit Ammoniumsulfat, Zentrifugation, Einfrieren des Pellets in flüssigem Stickstoff (200°C) und Aufbewahrung bei 80°C
  • Aufbewahrung als Lyophilisat
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