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Bakterielle Einschlusskörper - Inclusion Bodies

Detergenzien zur Isolierung von Proteinen aus Einschlusskörpern

Detergenzien sind amphiphile Moleküle. Sie bilden Mizellen, also Aggregate von Detergenz-Molekülen, bei denen der hydrophile Kopf nach außen zum wässrigen Lösungsmittel hin zeigt. Detergenzien solubilisieren Membranproteine, in dem sie die hydrophoben (membrandurchspannenden) Anteile des Proteins vom Kontakt mit dem wässrigen Lösungsmittel abschirmen.

Durch den Einsatz von Detergenzien gelingt es, dass die isolierten Proteine häufig einen signifikanten Anteil an Tertiärstruktur zurückerhalten. Außerdem ist eine Aggregation der Proteine nach ihrer Verdünnung seltener als bei vielen anderen Methoden. Verwendet werden anionische, kationische und zwitterionische Detergenzien. Die Konzentration des Detergenz muss dabei oberhalb der kritischen Mizellenkonzentration (CMC oder critical micell concentration) liegen, also umgerechnet zumeist in einem Bereich von ca. 0,5 bis 5 % (w/v). Die CMC ist die minimale Konzentration an Detergenz, bei dem noch Mizellen gebildet werden können. Eine hohe CMC bedeutet, dass dieses Detergenz bei Verdünnung schnell in seinen monomeren Zustand übergeht und sich durch Dialyse relativ leicht entfernen lässt (daher ist z.B. n-Octyl-β-D-glucopyranosid (OGP) besonders gut geeignet).

Detergenzien können Proteine bisweilen auch denaturieren. Dieses ist vor allem dann ein Problem, wenn sie sich bei der Konzentrierung eines Proteins anreichern. Zwitterionische Detergenzien sind effektiver im Unterbinden von Protein/Protein-Wechselwirkungen als nicht-ionische Detergenzien und minimieren oft die Gefahr einer Denaturierung. In diese Gruppe gehören z.B. CHAPS (3-[(Cholaminopropyl)dimethyl-ammonio]-1-propansulfonat) und die Sulfobetaine. Ein weitere Schwierigkeit besteht darin, dass bei ungenügend aufbereiteten Einschlusskörper-Präparationen auch Membran-gebundene Proteasen durch die Detergenzien in Lösung gebracht werden, die das Zielprotein unter Umständen degradieren können. Vermeiden lässt sich die unerwünschte Proteolyse durch:

  • Verwendung hochgereinigter Einschlusskörper-Fraktionen
  • Waschen der Einschlusskörper mit mildem Detergenz vor der Proteinisolierung
  • Solubilisierung der Proteine in Gegenwart von verschiedenen Protease-Inhibitoren, wie z.B. Phenyl-methyl-sulfonyl-fluorid (PMSF) (blockiert Serin-Proteasen) und EDTA1) (inhibiert Metallo-Proteasen; Chelatbildner).
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