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Bakterielle Einschlusskörper - Inclusion Bodies

Einschlusskörper (Inclusion Bodies)

Die bei Expression von Fremdprotein gelegentlich gebildeten sphärischen Einschlusskörper haben in E. coli einen Durchmesser von 0,2 bis 1,5 µm und beulen in einigen Fällen die Bakterienzelle regelrecht aus. In der Regel findet man nur einen Einschlusskörper pro Bakterienzelle, dieser ist nie membrangebunden und zeigt eine eher poröse Struktur.

Das Protein in den Einschlusskörpern ist i.d.R. vollständig synthetisiert, liegt aber in einem nur partiell gefalteten Zustand vor. Teilweise ist ein erstaunlich hoher Anteil der nativen Proteinstruktur erhalten: bei der β-Glucosidase können bis zu 30 %, bei der Endoglucanase nahezu 100 % des im Einschlusskörper vorliegenden Proteins in aktiver Konformation vorliegen. Dennoch ist in den meisten Fällen eine vollständige Denaturierung des Proteins notwendig, um die Proteine in eine Lösung zu bekommen, aus der sie dann wieder renaturiert werden können. Der erste Schritt der Isolierung dieses Proteins ist die Gewinnung der Einschlusskörper, gefolgt von einer Auflösung der Proteinaggregate. Das Protein in Einschlusskörpern ist meistens unlöslich in Salz oder nicht-ionischen Detergenzien, daher werden für die Solubilisierung zumeist ionische Detergenzien wie 1 % SDS und Denaturierungsmittel wie 8 M Harnstoff oder 6 M Guanidin/HCl verwendet.

Wie verhindert man die Ablagerung von Protein in Einschlußkörpern?

Es scheint keine einfache Korrelation zwischen der Bildung von Einschlusskörpern und der Art des Proteins zu geben. Wilkinson und Hamson fanden eine schwache Korrelation mit Ladungs- bzw. Faltungseigenschaften, denn die Tendenz zur Bildung von Einschlusskörpern steigt bei Proteinen mit hohem Anteil an Cys bzw. Pro oder bei stark hydrophoben Proteinen leicht an. Das homolog oder heterolog exprimierte Protein ist selten zu 100 % in Einschlusskörpern deponiert, meistens ist ein nicht unerheblicher Teil des Proteins löslich im Cytoplasma der Wirtzelle. Dieser Anteil des löslichen Proteins lässt sich mit einigen Tricks erhöhen:

  1. Senken der Wachstumstemperatur: Die hydrophobe Interaktion von Proteinen sinkt mit fallender Temperatur, und die Proteine haben mehr Zeit, in ihre native Konformation überzugehen. Der Temperaturabsenkung sind allerdings Grenzen gesetzt, da das Wirtsbakterium bei dieser Temperatur möglicherweise nicht mehr oder nur noch sehr langsam wachsen kann.
  2. Gemeinsame Expression mit Chaperonen: GroEL, GroES, DnaK und HtpG sind Proteine, die anderen Proteinen bei ihrer korrekten Faltung helfen. Diese Proteine sind evolutionär sehr stark konserviert und finden sich in allen Organismen, daher sind z.B. prokaryontische Chaperone in einer bakteriellen Wirtszelle durchaus nützlich, selbst wenn ein eukaryontisches Fremdprotein synthetisiert werden soll. Die Co-Expression von DnaK erhöht z.B. den löslichen Anteil von menschlichem Wachstumsfaktor (HGF) in E. coli um bis zu 87 % (Blum et al., 1992).
  3. Osmotischer Stress: Wachstum in Gegenwart von Glycylbetain (Glycin-Betain) und Sorbitol. Sorbitol ist notwendig, um Glycylbetain in die Zellen aufnehmen zu konnen, und Glycylbetain stabilisiert die neu synthetisiertenHerstellung von Fusionsproteinen: die Fusion des Proteins mit Thioredoxin erhöht im heterologen System die Stabilität (und damit den Anteil der löslichen Fraktion) von einigen Säuger-Cytokinen und Wachstumsfaktoren.

Literatur

Blum, P.; Velligan, M.; Lin, N.; Matin, A. (1992): DnaK-mediated alterations in human growth hormone protein inclusion bodies. . In: Biotechnology . 10 , 301-4
Wilkinson , D. L.; Harrison, R. G. (1991): Predicting the solubility of recombinant proteins in Escherichia coli.. In: Biotechnology. 9 , 443-8

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