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Proteinfaltung

Der Circulardichroismus

Die Circulardichroismus (CD)-Spektropolarimetrie (engl. circular dichroism) ist eine Methode, mit der man den Gehalt an Sekundärstruktur-Elementen eines Proteins bestimmen kann. Die spektroskopischen Eigenschaften eines Proteins sind dementsprechend verschieden für seinen gefalteten und den ungefalteten Zustand. Diese verändern sich beispielsweise, sobald aromatische Gruppen aus dem Protein-Inneren nach außen auf die Proteinoberfläche gelangen. Auch Intermediate lassen sich nachweisen. Dies ist u.a. relevant für strukturellen Analysen von überexprimierten rekombinanten Polypeptiden im Vergleich zu den nativen natürlich vorkommenden.

Proteine zeigen eine optische Aktivität, da die in ihnen vorhandenen Aminosäuren aufgrund ihrer L-Konfiguration am α-C-Atom (bis auf Glycin) optisch aktiv sind. Threonin und Isoleucin haben noch ein zweites asymmetrisches Zentrum. Auch die Wechselwirkungen zwischen den Aminosäure-Seitenketten eines Proteins tragen zur optischen Aktivität bei, so z.B. bei Helices oder Faltblatt-Strukturen in einem Protein.

Abb.1
CD-Spektren und Sekundärstruktur-Elemente

CD-Spektren basieren auf elektronischen Übergängen zwischen Grundzuständen und angeregten Zuständen von Molekülorbitalen (n → π*; π → π* Übergänge). Zur Anregung können unterschiedliche Strahlungsquellen verwendet werden. Bei Wellenlängen unterhalb von 190 nm wird zur Probenanregung häufig Synchrotron-Strahlung verwendet, weil diese über einen wesentlich höheren Lichtfluss als die normalerweise eingesetzten Xenon-Bogenlampen verfügt (so genannte SRCD = Synchrotron Radiation Circular Dichroism). Entsprechende Messmöglichkeiten bieten z.B. das BESSY des Helmholtz-Zentrum Berlin und - bis 2008 - das Synchrotron Radiation Source (SRS) in Daresbury (England).

Der Circulardichroismus ist wie folgt definiert (gemäß dem Lambert-Beer'schem Gesetz):

ΔA (λ) = [ ε (l) - ε (r) ] × l × c = Δε × l × c
Legende
A-Absorption
c-Konzentration in mol/L
l-optische Weglänge in cm
ε-molarer Extinktionskoeffizient in mol-1 cm-1

Häufig werden CD-Signale als molare Elliptizität θ angegeben, die mit ΔA(λ), gemäß folgender Gleichung zusammenhängt:

ΔA (λ) = θ 32.98

Im fernen UV-Bereich (insbesondere zwischen 170 und 240 nm) liefern CD-Spektren Informationen über die Konformation eines Proteins. α-helicale Struktur-Elemente zeigen ausgeprägt negative Banden bei 208 und 222 nm und eine positive Bande bei 190 nm (Abb. 1) . Ein unstrukturiertes Polypeptid (schwarze Kurve) weist dagegen negative Werte bei 192 nm auf. Auch β-Faltblatt-Strukturen lassen sich im CD identifizieren. Negative Banden bei ca. 215 nm charakterisieren den n → π* Übergang, während positive und negative Banden bei ~198 bzw. ~175 nm den π → π* Übergängen zuzuschreiben sind. Die in den CD-Spektren enthaltenen Informationen können wie individuelle Spektren für die einzelnen Sekundärstruktur-Elemente des untersuchten Proteins behandelt werden. Zur Datenauswertung werden in der Regel Spektren von Proteinen bekannter 3D-Struktur als Referenz benutzt, die in Datenbanken vorliegen (The Protein Circular Dichroism DataBank = PCDDB). DICHROWEB am Birkbeck College der Universität London ist ein Online-Server, der verschiedene Algorithmen bereitstellt, um CD-Spektren zu entfalten (Dekonvolution). Weisen Proteine einen hohen Gehalt an β-Faltblattstrukturen auf, wie z. B. das Porin aus der äußeren Membran von Bakterienzellen, so kann dies auch in D2O mit Hilfe der Fourier-Transform-Infrarot-Spekroskopie (FTIR)-Spektroskopie anhand der Feinstrukturanalyse der Amid-Bande I des Protein-Rückgrates untersucht werden. In diesem Beispiel komplementieren die Daten aus der FTIR-Spektroskopie diejenigen aus der CD-Spektropolarimetrie.

Ein Beispiel: Cytochrom c

Am Beispiel zeitaufgelöster Messungen von Circulardichroismus-Änderungen beim Cytochrom c wird deutlich, dass bei diesem Protein die Bildung von α-Helices sehr viel schneller erfolgt als die Umordnung zur nativen Tertiärstruktur ( (Abb. 2) , normierte Änderung des Circulardichroismus (ΔCD) als Funktion der Zeit bei λ = 289 bzw. bei 222 nm). Bei der Faltung von Cytochrom c werden innerhalb von 4 ms ca. 50 % der α-Helices des nativen Proteins gebildet, der Rest entsteht innerhalb von 10 ms bis ca. 1 s. Die Tertiärstruktur wird sehr viel später gebildet, dies lässt sich anhand der spektroskopischen Eigenschaften der aromatischen Aminosäuren zeigen.

Abb.2
Circulardichroismusänderungen am Cytochrom c

Zeitaufgelöste Messung von CD-Änderungen bei 289 nm und bei 222 nm am Cytochrom c

Literatur

Whitmore, L.; Wallace, B. A. (2004): DICHROWEB, an online server for protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopic data . In: Nucleic Acids Res.. 32 , W668-673
Janes, R. W. (2005): Bioinformatics analyses of circular dichroism protein reference databases. In: Bioinformatics. 21 (23) , 4230-4238
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